siRNA沉默Musashi-1基因表达对人HCT116结肠癌细胞生物学行为的影响

2012-07-07章福彬解放军第105医院消化内科安徽合肥230000

局解手术学杂志 2012年6期

章福彬，朱斌，唐郡，刘卫 (解放军第105医院消化内科，安徽合肥 230000)

Musashi是一种RNA结合蛋白，最早发现于果蝇，在维持干细胞状态、分化和肿瘤发生方面起着重要作用。本实验通过RNAi技术调控人HCT116结肠癌细胞Musashi-1基因表达水平，并检测干扰后细胞生物学行为的改变，探讨Musashi-1基因对结肠癌细胞增殖及细胞周期的影响，为探讨结肠癌中Musashi基因的功能提供新的手段。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

人结肠癌细胞株HCT116由本实验室保存，干扰质粒载体pGenSil-1购于武汉晶赛公司;Musashi-1 siRNA序列由上海吉凯公司合成，LipofectamineTM 2000 Reagent转染试剂和AnnexinV凋亡试剂购于Invitrogen公司，总RNA提取试剂(Trizol)和real time PCR试剂盒购于TaKaRa公司。

1.2 Musashi-1siRNA靶序列的设计与合成

根据GenBank的Musashi-1 mRNA(NM_002442)全长序列，按siRNA原则设计，经BLAST数据库分析未发现同源序列。设计基因靶点分别于Musashi-1基因的第205、741位点，靶序CCGGAGTTA。将化学合成的正义链和反义链退火，与经HindⅢ和BamHⅠ酶切后线性化pGeneSil-1载体连接，经筛选、酶切鉴定后测序。

1.3 细胞培养和转染

人结肠癌细胞株HCT116接种于含10%新生小牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的培养基中，细胞转染时，取对数生长期的HCT116细胞，以合适的细胞数接种于6孔培养板，用含10%血清不含抗生素的DMEM培养液、37℃、5%CO2温育过夜，次日转染。转染操作按LipofectamineTM 2000 Reagent说明书进行，转染24 h后将转染的细胞按1∶10稀释，将其种植于另一培养板，再经过24 h后，向培养液中加入400 μg/mL的G418进行抗性筛选，2周后荧光显微镜下可见细胞克隆发出荧光，对阳性克隆进行有限稀释，扩大培养后获得稳定表达的细胞株。