于永娟 牟芳芳 张泽安△

（1.上海中医药大学药物安全性评价中心，上海 201203；2.上海中医药大学解剖教研室，上海201203）

脑缺血缺氧性疾病是老年人多发和常见的一种疾病，由于脑缺血缺氧引起的细胞损伤涉及了多种信号通路异常，目前尚无特效药物用于临床。本文旨在通过观察EGb761对脑缺血大鼠脑细胞中P38/MAPK和MEK/ERK的影响，从形态学和分子水平阐述EGb761的药理作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SD雄性大鼠（300±10）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号2007000511866。

1.2 试剂 银杏叶提取物（金纳多片，20 mg/片，德国威玛舒培博士药厂）。10%水合氯醛溶液：上海国药集团。TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）：上海国药集团。Western blot相关试剂盒：购自碧云天，β-Actin： signaling technology company， Cat： #4967。P38：购自武汉博士德生物科技有限公司，BA1325。P-P38：Cell signaling technology company，Cat：#4631。 MEK： Cell signaling technology company，Cat：#9122。 P-MEK： Cell signaling technology company，Cat：#2338。 ERK： Cell signaling technology company，Cat：#4695。 P-ERK： Cell signaling technology company，Cat：#9106。 生物素化二抗：Vector，Cat：BA-1000。ABC： Vector，Cat： PK-6100。 DAB： Vector， Cat： SK-4100。

1.3 分组与给药 大鼠随机分为空白对照组9只，假手术组10只，模型组15只，EGb761低剂量（50 mg/kg）组15只和EGb761高剂量（100 mg/kg）组15只。每日1次口服给药，连续10 d。金纳多片用0.5%CMC配成混悬液，现配现用。假手术组给予0.5%CMC。

1.4 模型制备 给药第11日，制备大脑中动脉线栓（MCAO）脑缺血模型，使用内径约0.26 mm的尼龙线顺着颈内动脉到达大脑中动脉，阻塞血流实现栓塞模型。栓塞60 min后，轻轻抽出线头约2 cm，实现血流再灌注。造模前后脑血流减少＞75%认为造模成功，脑血流减少＜75%的动物剔除。再灌24 h后，处死动物，取脑，检测相关指标。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 TTC 染色［1］动物麻醉后腹主动脉放血，立刻取脑，切成厚约2～3 mm的薄片，浸入1%TTC中，37℃染色30 min，观察脑组织梗死面积。

1.5.2 免疫组化检测 脑组织固定于 10%甲醛中，24 h后脱水，常规方法制作切片。……