于永娟 牟芳芳 张泽安△

（1.上海中医药大学药物安全性评价中心，上海 201203；2.上海中医药大学解剖教研室，上海201203）

脑缺血缺氧性疾病是老年人多发和常见的一种疾病，由于脑缺血缺氧引起的细胞损伤涉及了多种信号通路异常，目前尚无特效药物用于临床。本文旨在通过观察EGb761对脑缺血大鼠脑细胞中P38/MAPK和MEK/ERK的影响，从形态学和分子水平阐述EGb761的药理作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SD雄性大鼠（300±10）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号2007000511866。

1.2 试剂 银杏叶提取物（金纳多片，20 mg/片，德国威玛舒培博士药厂）。10%水合氯醛溶液：上海国药集团。TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）：上海国药集团。Western blot相关试剂盒：购自碧云天，β-Actin： signaling technology company， Cat： #4967。P38：购自武汉博士德生物科技有限公司，BA1325。P-P38：Cell signaling technology company，Cat：#4631。 MEK： Cell signaling technology company，Cat：#9122。 P-MEK： Cell signaling technology company，Cat：#2338。 ERK： Cell signaling technology company，Cat：#4695。 P-ERK： Cell signaling technology company，Cat：#9106。 生物素化二抗：Vector，Cat：BA-1000。ABC： Vector，Cat： PK-6100。 DAB： Vector， Cat： SK-4100。

1.3 分组与给药 大鼠随机分为空白对照组9只，假手术组10只，模型组15只，EGb761低剂量（50 mg/kg）组15只和EGb761高剂量（100 mg/kg）组15只。每日1次口服给药，连续10 d。金纳多片用0.5%CMC配成混悬液，现配现用。假手术组给予0.5%CMC。

1.4 模型制备 给药第11日，制备大脑中动脉线栓（MCAO）脑缺血模型，使用内径约0.26 mm的尼龙线顺着颈内动脉到达大脑中动脉，阻塞血流实现栓塞模型。栓塞60 min后，轻轻抽出线头约2 cm，实现血流再灌注。造模前后脑血流减少＞75%认为造模成功，脑血流减少＜75%的动物剔除。再灌24 h后，处死动物，取脑，检测相关指标。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 TTC 染色［1］动物麻醉后腹主动脉放血，立刻取脑，切成厚约2～3 mm的薄片，浸入1%TTC中，37℃染色30 min，观察脑组织梗死面积。

1.5.2 免疫组化检测 脑组织固定于 10%甲醛中，24 h后脱水，常规方法制作切片。切片脱蜡，进行热抗原修复（柠檬酸缓冲液，pH=6.0，沸水中15 min），山羊正常血清封闭，一抗冰箱过夜，之后加入HRP标记的二抗，DAB显色。拍照，每张切片选取3个视野拍照，照片使用Nikon BR3.5图像分析软件分析定量。

1.5.3 Western blot检测 动物处死后立即取脑，加入蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂和裂解液匀浆，冰上裂解30 min。Bradford法进行蛋白定量，然后取70 μg蛋白上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜仪转膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4℃过夜，PBS清洗后滴加羊抗兔二抗，室温孵育2 h，PBS清洗，加入ECL后使用TANON4500凝胶成像系统检测蛋白表达。蛋白条带使用Quantityone软件进行定量。

1.6 统计学处理 应用SigmaSTAT4.0统计软件。 数据以（±s）表示，采用单因素方差分析Dunnett法统计。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EGb761对大鼠脑组织梗死体积的影响 见图1。染成红色部分为未缺血组织，白色部分为梗死组织。从结果可见，EGb761可剂量依赖性地减少大鼠脑组织梗死面积。

图1 大鼠脑TTC染色

2.2 EGb761对大鼠脑缺血性组织Caspase-9和Caspase-3的影响 见图2。与假手术组相比，不论皮质部位，还是海马部位，模型组动物Caspase-9和Caspase-3阳性细胞数显著性增多。EGb761各组Caspase-9/3阳性细胞较模型组明显减少（P＜0.05）。给予EGb761后，阳性细胞数剂量依赖性减少，但是Caspase-3表达仅有高剂量组教模型组具有显著性减少（P＜0.05），而Caspase-9的表达在EGb761-50和EGb761-100组均显著性减少（P＜0.05），这些结果表明，EGb761可剂量依赖性抑制凋亡信号传递，减少细胞凋亡。

图2 大鼠脑Caspase-9和Caspase-3免疫组化结果

图3 大鼠脑皮质P38/P-P38蛋白表达变化

2.3 EGb761对缺血大鼠脑皮质P-P38水平的影响 与假手术组相比，模型组动物皮质，P-P38 的表达显著上升（P＜0.05，图3），表明缺血性损伤时P38被激活了。EGb761给药后，P-P38的表达减少，与模型组相比，P-P38 的表达从模型组的（0.12±0.08）下降到给药 EGb761-100 后的（0.07±0.03），差异具有统计学意义（P＜ 0.05，图3）。 本实验结果表明，EGb761-100 mg/kg 给药显著性抑制了P38/MAPK信号分子在脑缺血大鼠脑皮质的激活。但是，EGb761组中P38蛋白与假手术组表达水平相似，无统计学差异 （P＞0.05）。这些数据表明，缺血性损伤能够直接引起P38/MAPK的磷酸化，从而引发下游信号的传递。由此，笔者推测EGb761的神经保护作用与抑制P38/MAPK信号传导有关。

2.4 EGb761给药抑制了缺血大鼠脑组织中P-ERK，P-MEK的磷酸化水平 从图4可见，与假手术组相比，ERK和MEK的总的蛋白水平在模型组和EGb761给药组均未见明显变化 （P＞0.05，图4），而P-ERK的表达在模型组显著高于假手术组（P＜0.05），分别为（0.05±0.04）和（0.16±0.05）。与模型组相比，P-MEK水平在EGb761各用药组均有显著下降（P＜0.05），但是P-ERK仅高剂量组相较模型组有显著下降（P ＜0.05），从模型组（0.16±0.05）下降至（0.10±0.05）。 P-MEK 的表达相较模型组，各用药组均显著性下降（P＜0.05），分别从模型组（1.02±0.04）下降至低剂量组的（0.67±0.20）和高剂量组的（0.74±0.21）。 这些结果表明，脑缺血后，MEK和ERK均被激活，EGb761给药后，一定程度上抑制了这两个蛋白激酶的活化。

图4 大鼠脑皮质MEK/ERK蛋白表达变化

3 讨 论

启动细胞凋亡一般通过两条途径，一条是内源性凋亡信号系统，以Caspase-9的激活为标志，另一条外源性凋亡信号通过激活Caspase-8，最终二者均可引起Caspase-3激活，启动细胞的凋亡［2］。已有实验证明P38/MAPK途径的激活会诱导细胞凋亡［3-4］。P38MAPK被磷酸化激活后，可以进一步激活其下游的激酶或多种转录因子，如蛋白激酶MAPKAPK2，转录因子ATF2，Elk-1等，产生一系列细胞内效应，促进诱导型一氧化氮合酶、选择素、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β 等分子表达［5-6］。这些基因表达产物在脑缺血损伤时的神经细胞凋亡、炎性反应等过程中发挥着重要作用，。大量实验数据也表明使用P38/MAPK的抑制剂可以减少缺血后细胞的凋亡［7］。本研究发现在缺血60 min再灌24 h的大鼠脑缺血区，与假手术组相比，模型组动物P-P38和P-ERK均激活了，而EGb761给药后，P-P38的表达减少（P＜0.05）。

Takagi等发现［8］，局灶性脑缺血再灌注后 5 min，皮质及海马的神经元中P38MAPK，再灌注30 min达到高峰，而再灌注后72 h，上述激酶活性增强的区域中可发现凋亡的神经元。表明P38激活促进了凋亡途径引起损伤。Ma XL等［7］研究发现SB 203580组与对照组相比，可减少缺血引起的心肌细胞死亡，进一步表明缺血性损伤引起的P38激活促进了细胞损伤，而抑制P38活性具有细胞保护作用，但机制未明。Kevin等［9］在沙土鼠脑缺血模型发现，p38/MAPK及其底物ATF2均有变化，MAPKAP2在脑缺血后持续数天活化，缺血后3～4 d酶活性最高，同时海马区锥状神经元缺损最多，而JNK1和ERK的活化不明显。

实验研究发现在缺血性疾病中，MEK激活的ERK促进了细胞损伤，因为MEK选择性抑制剂SL327在缺血前15 min会减少64%梗死面积，同时，SL327减少了59%的IL-1β mRNA的表达，但是TNF-α不变。表明MEK抑制剂通过减少IL-1β而神经保护作用［10］。另外，在MCAO造模前30 min和造模后30 min使用ERK的特异性阻断剂UO126均可减少MCAO后的损伤面积，认为其保护作用是通过抑制了缺血引起的p－ERK1/2激活实现的［11］，MEK/ERK的激活可以促进缺血后TNF-α的表达［12］，这些实验表明，MEK/ERK通路在脑缺血时的激活促进了炎性因子释放，从而加重了细胞损伤。通过抑制MEK/ERK的激活，会缓解炎性因子对细胞的损伤，同时直接或间接抑制细胞凋亡，发挥缺血后的神经保护作用。

本实验中大鼠脑缺血后P-ERK表达明显增加，与QiaoH等［13-14］的结果相同，而EGB761用药后，与大鼠大脑中动脉栓塞再灌模型组相比，脑组织梗死面积减少，凋亡标记TUNEL染色阳性的细胞显著性减少，Caspase-3表达减少。Caspase-3是启动凋亡程序的重要的蛋白分子，Caspase-3阳性细胞数的减少充分论证了EGb761可以抑制细胞的凋亡，同时在大鼠缺血后皮质发现P-MEK和P-ERK在EGb761给药组显著下降（图4）。由此，笔者认为，EGb761通过抑制MEK/ERK的激活，阻断了内源性凋亡通路的激活，从而减少了细胞的凋亡。

本实验从形态学和蛋白表达水平研究了EGb761对脑缺血的神经保护作用及涉及的信号通路。从结果可知，EGb761可以通过抑制细胞凋亡发挥了缺血性损伤中的细胞保护作用，其作用机理涉及了凋亡通路，P38/MAPK和MEK/ERK信号通路。由于EGb761的多靶点药理作用和对细胞无毒性的特点，本研究认为其是一种可以有效预防和治疗脑缺血的中药，具有开发前景。

致谢：感谢上海中医药大学安评中心老师和同学们的无私帮助。

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