谢 俏 李汇华 李 鑫 徐有青

本实验研究了Notch 信号通路在酒精培养C3A细胞中的表达以及Notch 信号通路抑制剂3，5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S 苯基甘氨酸 t-丁酯（DAPT）对细胞增殖的影响。

材料与方法

一、试验细胞 C3A 细胞系本实验室保存。

二、试剂 高糖DMEM 培养基、噻唑蓝（MTT）、95%乙醇购自中国医学科学院细胞中心；胎牛血清购自美国 GIBICO 公司；DAPT 购自Sigma-Aldrich 公司；DMSO 购自 Bio-Tech 公司；兔抗人NICD1 购自加拿大Epitomics 公司；兔抗人HES-1 购自Millipore 公司；抗β-actin 抗体购自美国 Santa Cruze 公司；鼠抗兔IgG 购自美国 Cell Signaling 公司；Trizol 购自美国 Invitrogen 公司；发光液购自美国Millipore 公司。

三、细胞培养和处理 取C3A 细胞和CYP2E1 细胞，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2 和饱和湿度的细胞培养箱中培养，2～3d 换液，5d 传代。收集对数生长期细胞，离心（1000rpm，5min）后弃上清，用1mlDMEM完全培养基重悬、计数。根据文献[8]的描述，选取100mM为酒精作用浓度，24 小时为酒精作用时间，来模拟体外酒精性肝病模型。用封口膜封住细胞培养皿和96 孔板，以防酒精挥发。细胞在加酒精刺激前用不含胎牛血清的培养基培养（饥饿）24h。DAPT 组用 10μmol/L DAPT 预处理 C3A 细胞和CYP2E1 细胞24 小时，然后再加入酒精处理。

四、MTT 法检测细胞增殖 取约3×104细胞，接种于96 孔板中，细胞贴壁后处于对数生长期时，按分组情况在培养基中加酒精和DAPT 共培养24h，吸弃培养基，每孔加入 MTT（5.0g/L）20μL，继续培养4h，吸弃上清，每孔加入DMSO150μL，避光振荡15min，应用全自动酶标仪检测490nm 处各孔的吸光度A490nm，实验重复3 次，通过公式计算细胞存活率，即细胞存活率=A 对照组/A 实验组×100%

五、Western-blot 检测Notch 下游蛋白NICD1和HES1 的表达 取约2.6×107细胞，悬于细胞裂解液中冰浴30min，裂解细胞，离心（12 000rpm，15min），提取蛋白质，定量后取90μg 蛋白与5×加样缓冲液混匀，100℃变性5min，冷却后上样。……