鲍涵，张忠义，张军，黄宝明（.广州中医药大学，广州 50405；2.南方医科大学珠江医院，广州 50280）

热毒清颗粒由金银花、连翘、大青叶、荆芥、钩藤等15味药材组成，具有疏风解表、清热解毒、利咽止咳等功能，主治风热兼湿型外感，症见发热、咽喉肿痛、咳嗽等。金银花和连翘为君药，绿原酸及连翘酯苷A分别为其指标性成分，其中绿原酸具有广泛的抗菌活性[1，2]，还具有抗病毒[3]、抗炎解热[4]等作用；连翘酯苷A具有很强的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、白色念珠菌有明显的抑制作用[5]，且体外抑病毒作用较强，尤其对呼吸道最常见病毒合胞病毒具有明显的体外抑制作用[6]，同时对活性氧具有较强的清除能力，是一种有效的天然抗氧化剂[7]。笔者采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定热毒清颗粒中绿原酸和连翘酯苷A的含量，方法简单、快捷，可用于热毒清颗粒的质量控制。

1 仪器与试药

LC-20A型HPLC系统，包括紫外检测器、LC-20AT型泵、SIL-20A型自动进样器、Lab solution色谱工作站（日本岛津公司）；CP225D型万分之一分析天平、AB204-N型十万分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号:110753-200413）；连翘酯苷A对照品（上海融禾医药科技有限公司，批号:100920）；热毒清颗粒（南方医科大学珠江医院自制，批号:110509、110510、110511）；甲醇（色谱纯，德国默克公司），液相用水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex C18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相:甲醇为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，梯度洗脱程序为0（22%A）→10min（30%A）→13min（34%A）→30min（34%A）→32min（22%A）→35min（22%A）；流速:1.0mL·min－1；检测波长:330 nm；进样量:10µL；柱温:25℃。在此色谱条件下，绿原酸和连翘酯苷A分离度良好，空白无干扰。色谱见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品5.62mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为绿原酸对照品贮备液（每1mL含绿原酸0.562mg）。

图1 高效液相色谱图A.热毒清颗粒；B.绿原酸对照品；C.连翘酯苷A对照品；D.连翘阴性对照；E.金银花、钩藤阴性对照；1.绿原酸；2.连翘酯苷AFig 1 HPLC chromatogramsA.reduqing granules；B.chlorogenic acid control；C.forsythoside A control；D.negative control of Forsythia suspensa；E.negative control of Lonicera japonica and Gambir Plant；1.chlorogenic acid；2.forsythoside A

精密称取连翘酯苷A对照品4.11mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为连翘酯苷A对照品贮备液（每1mL含连翘酯苷A0.0822mg）。

精密量取绿原酸对照品贮备液、连翘酯苷A对照品贮备液各2.5mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含绿原酸0.1405mg、连翘酯苷A 0.0206mg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取“装量差异”[8]项下的本品内容物，混匀，取适量，研细，取约1.5 g，精密称定，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方比例分别制备缺金银花和钩藤（绿原酸）或连翘（连翘酯苷A）的阴性颗粒，并按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液2、6、10、12、16、20μL，注入HPLC仪，每个样品测定2次，记录色谱峰面积。分别以绿原酸、连翘酯苷A进样量（X，µg）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得绿原酸的回归方程为Y＝2663957.8586X－1738.8921（r＝0.9999）。结果表明，绿原酸进样量在0.0562～0.5620µg范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系；连翘酯苷A的回归方程为Y＝1154713.1929X－819.0719（r＝0.9999）。结果表明，连翘酯苷A进样量在0.0411～0.4110µg范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

分别精密吸取绿原酸和连翘酯苷A混合对照品溶液适量，微孔滤膜滤过，取续滤液，连续测定6次，记录色谱峰面积。结果，混合对照品溶液中绿原酸平均峰面积为2457.3361，RSD＝0.30%；连翘酯苷A平均峰面积为615.6706，RSD＝0.24%，表明仪器精密度良好。

2.5 中间精密度试验

采用戴安680型HPLC仪，Kromasil C18色谱柱进行试验。精密吸取绿原酸和连翘酯苷A混合对照品溶液适量，微孔滤膜滤过，取续滤液，连续测定6次，记录色谱峰面积。结果，绿原酸峰面积为6.9649，RSD＝0.83%；连翘酯苷A峰面积为1.9029，RSD＝0.72%，表明中间精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、12、24h进样，测定绿原酸和连翘酯苷A的峰面积。结果，绿原酸平均峰面积为1126153.0，RSD＝0.25%（n＝6）；连翘酯苷A平均峰面积为371707.5，RSD＝0.53%（n＝6），表明供试品溶液在24h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批样品适量，平行制备6份供试品溶液，进样测定。结果，绿原酸平均含量为1.2323mg·g－1，RSD＝0.97%；连翘酯苷A平均含量为1.1019mg·g－1，RSD＝1.12%，表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的热毒清颗粒适量，共6份，分别精密加入绿原酸和连翘酯苷A对照品适量，按“2.2.2”项下方法操作，测定并计算绿原酸和连翘酯苷A的加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Result of recovery tests（n＝6）

2.9 样品含量测定

取热毒清颗粒3批样品（批号:110509、110510、110511）“装量差异”[8]项下的内容物适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10μL，注入HPLC仪中进行测定，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg·g－1）Tab 2 Content determination of samples（mg·g－1）

3 讨论

连翘酯苷A作为一种酚性成分，一直以来都被视为连翘的主要有效成分，但其结构较为复杂，遇酸、碱或高温等不稳定，易引起分解，所以对其含量进行检测更加显得重要[9]。本法流动相中采用0.1%磷酸溶液可以很好地提高组分的分离度，使连翘酯苷A和绿原酸分离度均＞1.5，可以同时直接测定这2个组分含量；改进了各组分色谱峰的峰形，改善峰的脱尾现象，拖尾因子在0.95～1.05范围内；缺样无干扰，方法专属性良好。金银花与连翘在中药复方中多配伍使用，笔者以HPLC法同时测定热毒清颗粒中有效成分绿原酸和连翘酯苷A的含量，分离效果理想，重复性好，简便快捷，可用于热毒清颗粒的质量控制。

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[2]唐 敏，刘 耀，王 渝，等.金银花黄酮粗提物体外抑菌作用研究[J].中国药房，2008，19（30）:2321.

[3]潘曌曌，王雪峰，闫丽娟，等.金银花提取物体外抗甲型流感病毒FM1株的研究[J].中国中医药信息杂志，2007，14（6）:37.

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[5]刘 明.中药连翘药理作用的研究近况[J].现代医药卫生，2007，23（16）:2438.

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[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010:附录15.

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