HRM方法检测非小细胞肺癌患者胸水标本癌细胞基因突变的临床意义

2012-05-02吕伟朋姜振富吕海辰

大连医科大学学报 2012年4期

李梅，吕伟朋，韦鸿，姜振富，吕海辰，吕申

(1.大连医科大学附属第二医院实验中心，辽宁大连116027;2.大连医科大学附属第二医院神经外科，辽宁大连116027; 3.复旦大学上海医学院临床医学(8年制)2007级，上海200032)

李梅1，吕伟朋1，韦鸿1，姜振富2，吕海辰3，吕申1

［目的］探讨应用HRM方法检测非小细胞肺癌患者胸水标本癌细胞EGFR、KRAS基因突变用于指导EGFR酪氨酸激酶受体抑制剂治疗的可行性。［方法］收集36例非小细胞肺癌患者胸水标本，常规提取DNA，HRM方法检测KRAS基因第2外显子、EGFR基因第19和21外显子突变。统计分析胸水标本与前期检测过的非小细胞肺癌组织KRAS、EGFR突变率差异。［结果］胸水标本36例中，2例(5.6%)KRAS突变，10例(27.8%)EGFR突变(其中EGFR第19和21外显子突变各5例)。前期检测过的非小细胞肺癌组织KRAS和EGFR突变率分别为5.8%和36.3%。KRAS和EGFR突变率在胸水标本与前期非小细胞肺癌组织中差异均无显著性意义(P＞0.05)。［结论］对难以获得肺癌组织标本的非小细胞肺癌患者可应用HRM方法检测胸水标本筛查KRAS、EGFR基因突变，指导EGFR酪氨酸激酶受体抑制剂应用。

HRM;胸水标本;非小细胞肺癌

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要类型，手术治疗和化疗是对其治疗的主要手段。然而一些晚期NSCLC患者，因失去了手术机会，只能通过化疗控制肿瘤的生长，延长生命。近年来分子靶向药表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFRTKI)，如Gefitinib等在临床逐渐推广使用。该类药物以其疗效好、毒副作用小的特点给NSCLC患者带来了希望。该药物的针对性很强，患者间疗效差异很大，且药价昂贵。因此，在用药前有效判断NSCLC患者对该药的敏感性非常必要。目前认为EGFR第19或21外显子突变是NSCLC对EGFRTKI药物敏感的标志，而KRAS第2外显子突变则是耐药的标志。所以NSCLC患者在接受EGFRTKI类药物治疗前，通常需要检测肿瘤细胞的这3段基因突变情况，以确定是否用药。对于手术NSCLC患者，通常可以利用手术切除的癌组织标本检测这3段基因的突变情况，但一些失去手术机会的患者常因为无法获取肿瘤组织而失去对药物敏感性检测的机会。如果能够从较容易获得的胸水标本中检测上述3段基因突变情况，以此获得患者对药物敏感状况的信息将具有重要临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 标本收集

收集2009年—2010年大连医科大学附属第二医院经细胞学或病理学检查确诊为非小细胞肺癌的患者胸水36份。NSCLC患者中，男19例，女17例，年龄(63.8±13.9)岁。

1.2 DNA提取和HRM法基因突变检测

常规DNA提取试剂盒法(天根生物技术有限公司北京)提取胸水标本DNA，常规PCR扩增EGFR第19、21外显子和KRAS第2外显子，引物，反应条件、反应体系同前［1-2］。应用 High resolution melting(HRM)方法进行基因突变检测，应用Lightscanner(Idaho Technology USA)在温度72～90℃收集荧光信号［1-2］。

1.3 统计学方法

数据分析应用SPSS 15.0统计软件进行，应用χ2检验比较胸水标本与前期新鲜肺癌组织标本KRAS第2外显子及EGFR第19、21外显子突变率差异，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KRAS突变检测

HRM法检测KRAS基因突变结果显示(图1):胸水标本36例中KRAS第2外显子突变共2例(5.6%)，均为腺癌，患者男性1例、女性1例。

前期应用HRM方法检测103例NSCLC患者手术切除肺癌组织KRAS突变，发现突变的共6例(5.8%)［1］。应用HRM方法检测肺癌组织标本和胸水标本中KRAS突变，两种标本中KRAS突变率差异无显著性意义(P＞0.05)。

图1 HRM法检测KRAS第2外显子突变结果Fig 1 Detecting KRAS mutation in exon 2 with HRM

2.2 EGFR突变检测

HRM法检测EGFR基因突变结果显示(图2、3):胸水标本36例中EGFR第19、21外显子突变共10例(27.8%)，其中19外显子突变5例，均为腺癌，患者女性2例、男性3例;21外显子突变5例，均为腺癌，患者女性3例、男性2例。

前期应用HRM方法检测157例NSCLC患者手术切除肺癌组织EGFR突变，发现19、21外显子突变共57例(36.3%)［2］。应用HRM方法检测肺癌组织标本和胸水标本中EGFR突变，两种标本中EGFR突变率差异无显著性意义(P＞0.05)。

图2 HRM法检测EGFR第19外显子突变结果Fig 2 Detecting EGFR mutation in exon 19 with HRM

图3 HRM法检测EGFR第21外显子突变结果Fig 3 Detecting EGFR mutation in exon 21 with HRM

3 讨论

分子靶向药物 EGFR-TKI的出现及其在NSCLC治疗中的应用为NSCLC患者治疗带来希望。该药针对性强、疗效好、毒副作用小，但价格昂贵，如果不敏感患者盲目用药，不但贻误治疗时机，同时也带来家庭经济负担。因此，用药前的敏感性检测是有的放矢用药得以实施的关键。2004年New England Journal Medicine和Science先后报道了有EGFR第19和21外显子突变肿瘤的患者常对Gefitinib等EGFR-TKI药物敏感，相反有KRAS第2外显子突变肿瘤的患者多表现为对该类药物的耐药，随后大量研究也证实EGFR和KRAS突变可以作为反映EGFR-TKI药物敏感性的分子标志［3-7］。对于手术治疗的NSCLC患者可以应用手术切除的癌组织(无论新鲜癌组织还是石蜡包埋的癌组织)进行基因检测，对于失去手术机会的晚期NSCLC患者可以通过穿刺获得癌组织标本用于基因检测，但穿刺风险大，临床实施困难。胸水常出现在晚期NSCLC患者，但胸水中癌细胞数量不定，有时癌细胞数量极少，甚至找不到癌细胞，如果基因检测方法灵敏度不高就会出现假阴性的结果。因此，灵敏的基因检测方法是能否利用胸水检测EGFR和KRAS基因突变，并判断患者对EGFR-TKI药物敏感性的关键。HRM方法是近年来出现的准确、敏感、快速基因突变检测方法，而且检测过程均为闭管操作，能有效地避免污染机会，是可用于临床的、便捷基因突变检测方法。本研究组在国内率先从美国引进了该技术，应用该技术从突变细胞比例低至2.5%的混合样品中检测出了变异基因［1］。通过比较胸水标本与肺癌组织标本的该方法EGFR、KRAS基因突变检出率，作者发现两种样本的EGFR、KRAS基因突变检出率几乎相同，没有统计学上的显著差异。这提示HRM方法可用于检测胸水标本的EGFR、KRAS基因突变。本研究结果EGFR突变患者中男性患者比例较大，而KRAS突变患者中女性患者比例较大，这与作者的前期研究结果以及其他研究机构的研究结果不一致，可能是由于样本例数少所致，今后还将增加病例数进一步研究。

总之，检测胸水EGFR和KRAS基因突变HRM方法的建立对指导晚期NSCLC患者EGFR-TKI药物的应用有重要意义。

［1］Li Mei，Liu Lina，Liu Zhimin，et al.The status of KRAS mutations in patients with non-small cell lung cancers from mainland China［J］.Oncol Reports，2009，22(5):1013-1020.

［2］Li Mei，Zhang Qiuping，Liu Lina，et al.The different clinical significance of EGFR mutations in exon 19 and 21 in nonsmall cell lung cancer patients of China［J］.Neoplasma，2011，58(1):74-81.

［3］Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，et al.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib［J］.N Engl J Med，2004，350(21):2129-2139.

［4］Paez JG，Janne PA，Lee JC，et al.EGFR mutations in lung cancer:correlation with clinical response to gefitinib therapy［J］.Science，2004，304(5676):1497-1500.

［5］Eck MJ，Yun CH.Structural and mechanistic underpinnings of the differential drug sensitivity of EGFR mutations in non-small cell lung cancer［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1804(3):559-566.

［6］Kosaka T，Yatabe Y，Onozato R，et al.Prognostic implication of EGFR，KRAS，and TP53 gene mutations in a large cohort of Japanese patients with surgically treated lung adenocarcinoma［J］.JTO，2009，4(1):22-29.

［7］Jang TW，Oak CH，Chang HK，et al.EGFR and KRAS mutations in patients with adenocarcinoma of the lung［J］.Korean J Intern Med，2009，24(1):48-54.

Feasibility of HRM to detect gene mutations in hydrothorax of patients with non-small cell lung cancer

LI Mei1，LÜ Wei-peng1，WEI Hong1，JIANG Zhen-fu2，LÜ Hai-chen3，LÜ Shen1
(1.Laboratory Center，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116027，China;2.Neurosurgery Department，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116027，China;3.2007 8-year-MD Candidate，Shanghai Medical University Fudan University，Shanghai 200032，China)

［Objective］To explore the clinical significance of HRM to detect EGFR and KRAS gene mutations in hydrothorax of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)for directing EGFR tyrosine kinase inhibitor therapy.［Methods］The mutations of KRAS gene in exon 2 and EGFR gene in exon 19，21 were detected with HRM.The frequencies of EGFR and KRAS mutations between hydrothorax samples and cancer tissue samples from patients with NSCLC were analyzed statistically.［Results］There were 2 cases(5.6%)with KRAS mutations and 10 cases(27.8%)with EGFR mutations，including 4 cases in exon 19 and 5 cases in exon 21 found in hydrothorax with HRM.The frequencies of KRAS and EGFR mutation，detected in NSCLC tissues before，were 5.8%and 36.3%separately.There was no significant differencein either KRAS or EGFR between hydrothorax and cancer tissue samples.［Conclusion］It is helpful to patients with NSCLC who have lost the operation opportunity to detect the gene mutation in hydrothorax with HRM in directing the EGFR tyrosine kinase inhibitor therapy.

HRM;hydrothorax samples;non-small cell lung cancer

R730

1671-7295(2012)04-0321-03

国家自然科学基金项目(81071805)

2012-04-05;2012-06-20

李梅(1977-)，女，辽宁抚顺人，主治医师。

吕申，教授，博士生导师。E-mail:lvshen1956@yahoo.com.cn