杨 华 ，邓义德 ，胡高云

(1．湖南汉森医药研究有限公司，湖南 长沙 410013;2．中南大学，湖南 长沙 410013)

枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL．及其栽培变种的干燥未成熟果实[1]，性微寒，味苦、辛、酸，入肺、脾、大肠经，具有理气宽中、行滞消胀的功效，主治胸肋气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、胃下垂等[2－3]。枳壳中含黄酮、生物碱、糖类和有机酸等成分，黄酮为枳壳药材主要有效成分。枳壳主要的黄酮类成分为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异柚皮苷、橘红素、川陈皮素等[4－6]。2010年版《中国药典(一部)》枳壳药材质量标准对柚皮苷和新橙皮苷进行含量测定[7]，而异柚皮苷和橙皮苷分别是柚皮苷和新橙皮苷的同分异构体，只有连接的糖基为鼠李糖或葡萄糖的差异，且文献报道异柚皮苷和橙皮苷具有多种活性[8－9]。因而建立以柚皮苷、新橙皮苷、异柚皮苷、橙皮苷4个黄酮类成分为指标的含量测定方法，可为枳壳药材质量控制提供参考。另以4个成分为指标，考察了不同产地的枳壳药材最佳采收期。现报道如下。

1 仪器与试药

美国安捷伦公司1100型液相色谱仪(美国安捷伦公司)，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、检测器、工作站;KQ－250DB型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);METTLER 200型电子天平;BP211D型电子分析天平(Sartorius CO．);DHG－9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。柚皮苷对照品(批号为110722－201111)，新橙皮苷对照品(批号为111857－201102)，橙皮苷对照品(批号为110721－200613)，均由中国药品生物制品检定所提供;异柚皮苷对照品(上海融禾医药科技有限公司提供，批号为090926);乙腈、无水乙醇为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。枳壳药材采自重庆、湖南、江西等地。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱:Venusil XBP C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:乙腈－0．1%甲酸，流动相比例见表1;检测波长:283 nm;流速:1 mL/min;柱温:30℃，理论板数按柚皮苷计算应不低于3 000。

2．2 溶液制备

精密称取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL各含柚皮苷1 mg、橙皮苷25 μg、新橙皮苷0．45 mg、异柚皮苷80 μg的混合溶液，即得对照品溶液。取样品中粉0．5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加25 mL 70%甲醇，超声30 min(功率250 W，频率40 kHz)，放冷，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

2．3 方法学考察

线性关系考察:取柚皮苷适量，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷1．016 4 mg 的贮备液，分别稀释成 1 016．4，762．3，508．2，203．3，101．64 μg/mL，进样量 5 μL，绘制标准曲线，得回归方程。柚皮苷在 0．5 ～5 μg范围线性关系良好，Y=7．559 25X+19．268，r=0．9998。取异柚皮苷适量，加甲醇制成每1mL含异柚皮苷0．4024 mg的贮备液，分别稀释成 402．4，321．92，241．44，160．96，80．48，16．096 μg/mL，进样量 5 μL，绘制标准曲线，得回归方程。异柚皮苷在 0．08 ～2．01 μg范围线性关系良好，Y=7．544 7X－2．336 9，r=0．999 8。取橙皮苷适量，加甲醇制成每 1 mL含橙皮苷0．241 2 mg 的贮备液，分别稀释成 241．2，96．48，48．24，24．12，12．06 μg/mL，进样量 5 μL，绘制标准曲线，得回归方程。橙皮苷在 0．06 ～1．2 μg 范围线性关系良好，Y=8．661 1X+7．252，r=0．9999。取新橙皮苷适量，加甲醇制成每1mL含新橙皮苷0．9644mg的贮备液，分别稀释成 964．4，482．2，192．88，96．44，38．576，19．288 μg/mL，进样量 5 μL，绘制标准曲线，得回归方程。新橙皮苷在 0．09～4．82 μg范围线性关系良好，Y=9．249 4X－18．171，r=0．999 7。见图 1。

表1 流动相比例

精密度试验:选中间浓度的对照品溶液混合溶液(柚皮苷508．2 μg/mL、异柚皮苷 160．96 μg/mL、橙皮苷 48．24 μg/mL、新橙皮苷192．88 μg/mL)，在上述色谱条件下连续进样6次，记录色谱峰面积，结果柚皮苷、异柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的RSD分别为 0．86%，0．92%，1．23%和 1．11%。

重复性试验:取本品(江西，20110712)，按供试品溶液方法制备6份，按上述色谱条件检测，异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积的RSD在0．92% ～1．32%间，说明方法的重复性良好。

图1 枳壳药材HPLC色谱图

稳定性试验:取同一供试品溶液，按供试品溶液方法制备，按拟订色谱条件分别在 0，4，8，15，24，48 h 时进行检测，考察其稳定性。结果异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积的RSD为0．24% ～3．40%，表明样品溶液在48 h内稳定。

加样回收试验:取已知含量的样品溶液1 mL，分别加入对照品适量，按2．2项下方法处理，平行试验6次，测定结果见表2。

表2 加样回收试验结果(n=6)

2．4 样品含量测定

取枳壳样品，按上述方法测定，按干燥品计算枳壳中4个成分的含量，结果见表3。24批枳壳样品中异柚皮苷的平均含量为0．59%;柚皮苷的平均含量为6．73%;橙皮苷的平均含量为1．15%;新橙皮苷的平均含量为4．96%。

3 讨论

对以水或含水甲醇为溶剂制备枳壳供试品溶液，其4个成分的提取率、理论板数、对称性都接近，峰面积无显著性差异。但随着甲醇量的增加，后续的试验处理更容易，所以选择70%的甲醇作为供试品溶液的制备溶剂。

采收时间对枳壳药材中的化学成分影响非常大。以重庆的样本为例，从7月初开始每周分别进行采样，分析结果不难看出:随着果实成熟期的到来，药材中含量较高的主要成分柚皮苷和新橙皮苷的含量渐渐下降，而2个含量较低的成分异柚皮苷和橙皮苷的含量有升高的趋势。说明药材应该在7月中旬以前完成采收。湖南的样品也如此，3个产地(益阳、新干、樟树)的样品均以小暑前的柚皮苷和新橙皮苷的含量为最高，大暑前降为最低。但从江西产的2个品种(香橙和臭橙)的枳壳来看，药材中含量较高的2个主要成分柚皮苷和新橙皮苷的含量总体上来说在小署前后的变化不大，以小暑前稍高。且2个品种中的柚皮苷和新橙皮苷的含量相差不大，异柚皮苷和橙皮苷的含量也是同样如此。从不同产地的情况进行分析，3个产地的样品以江西和重庆的样品中指标成分的含量较高，但均符合《中国药典》对枳壳药材的规定。通过试验，可以确定枳壳药材的采收时间应以6月中旬到7月中旬间(小署前后)为宜。

本方法简便、准确、可靠，比药典方法增加了2个有效成分的含量测定，对枳壳药材质量控制具有一定参考价值。

表3 样品含量测定结果

[1]肖培根．新编中药志(第2卷)[M]．北京:化学工业出版社，2001:443－447．

[2]罗小泉，杨武亮，周至明，等．中药枳壳药材的研究概况[J]．江西中医学院学报，2006，18(2):45 －47．

[3]潘隽丽，杨翠平，苏薇薇．枳壳类药材的研究概况[J]．中药材，2003，26(10):768－771．

[4]杨武亮，陈海芳，余宝金，等．枳壳活性化学成分研究[J]．中药材，2008，31(12):1 812 －1 815．

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[6]季 忆，陈建真，陈建明．枳壳黄酮类成分的研究进展[J]．中国中医药信息杂志，2010，17(11):105 －107．

[7]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京:中国医药科技出版社，2010:229－230．

[8]张冬松，高慧媛，吴立军．橙皮苷的药理活性研究进展[J]．中国现代中药，2006，8(7):25 －27．

[9]Funaguchi N，Ohno Y，La BL，et al．Narirutin inhibits airway inflammation in an allergic mouse model[J]．Clin Exp Pharmacol Physiol，2007，34(8):766－770．