吴剑宏，阮狄克，王德利，张 超，何 勍，王超锋，张 燕，辛洪奎，顾 韬，徐 成，刘 玥

近年来，基因治疗成为椎间盘退变性疾病生物学治疗的研究热点。随着对端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)基因研究的深入，通过载体将TERT基因转入细胞，进而激活细胞端粒酶活性，使细胞延长寿命，甚至使细胞“永生化”成为可能［1-2］。腺相关病毒是目前在基因治疗研究领域常使用的一种病毒类载体［3］，本研究使用腺相关病毒为载体介导人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因转染人椎间盘髓核细胞，评估重组腺相关病毒人端粒酶逆转录酶基因(recombinant adeno-associated virus vector-mediated hTERT gene，rAAV-hTERT)是否能转染体外培养人髓核细胞，并对其安全性相关指标进行检测，为进一步的功能研究及在体研究提供安全性证据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

DMEM培养液、PBS液(Hyclone)、胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)(Gibco)，0.25%Trypsin-EDTA(Gibco)，trizol液(Invitrogen)，Ⅱ型胶原酶(碧云天)，鼠抗人hTERT蛋白单抗及羊抗兔/鼠二抗(Abcam)。PCR、RT-PCR 试剂盒(Promega)，75 μm的细胞滤膜(Millipore)，6孔培养板(corning)，PCR引物根据PCR引物设计原则，按照hTERT及甘油醛-3-磷酸 脱 氢 酶 (glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)基因序列，利用 Prime Premer 5软件设计，由北京博迈德生物公司合成。3～4周龄裸鼠由北京大学医学部动物中心提供。rAAV-hTERT(病毒滴度=1×1012μg/mL)由北京五加和生物技术公司包装。Hela细胞由解放军307医院妇产科实验室惠赠。

1.2 方法

1.2.1 人椎间盘髓核细胞的分离与培养

椎间盘髓核标本来源于1名19岁男性的正常椎间盘髓核组织，将标本用PBS清洗2次后仔细分离出髓核组织，将髓核组织修剪成1 mm3大小的组织块，0.025% Ⅱ型胶原酶置于 37°C、5%CO2的细胞培养箱中消化14～16 h，将消化液用75 μm的细胞滤膜过滤，收集细胞以1×105/孔的密度培养于6孔培养板，以含10%FBS的DMEM为培养液，置于37°C含5%CO2的细胞培养箱中，2～3 d换液1次，于倒置显微镜下观察细胞生长状态。……