北京市药品审评中心（100053）马书章 田晓娟 佟利家

核酸检测（Nucleic acid testing，NAT）技术作为血液筛查的一种新方法，可显著缩短检测方法的“窗口期”，降低输血感染病毒的风险，因此，该技术已成为美国、日本等发达国家血源筛查的必要手段[1][2][3][4][5]。根据我国现行法规要求，用于血源筛查的体外诊断试剂按照药品管理。目前，国内许多企业已经开发出成熟的NAT定量检测产品，但这些产品均只能获得国家食品药品监督管理局（SFDA）的临床诊断使用许可，而临床诊断和血液筛检是两个不同的应用领域，血液筛查对试剂的要求比临床诊断严格很多。现就NAT血源筛查的研究现状及企业研发过程中应注意的问题进行探讨。

1 NAT用于血筛的研究现状

目前，广泛应用于临床血液筛检的酶免检测（enzyme immunoassay，EIA）技术，随着单克隆抗体的应用及灵敏度更高的发光平台的建立，灵敏度和特异性在不断地改进和提高，但每年仍有少数新发输血后肝炎病例报道。除了方法学本身的限制，这些危险主要来自：病毒感染者“窗口期”献血，病毒变异，免疫静默感染以及人工操作错误。ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）检测的“窗口期”较长，ELISA技术“窗口期”漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈。因此，单纯ELISA检测已不能有效地保障血液安全。

NAT检测是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称，其灵敏度高，可检测出标本中极微量的核酸，在病毒感染后数天即能检出，可大大缩短“窗口期”。免疫学检测HBsAg、抗-HIV、抗-HCV的“窗口期”分别为56天、22天、70天[6]。在理论上，NAT技术能够显著的缩短病原体检出的“窗口期”[7]。有研究表明：NAT可将HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”缩短25天（缩短“窗口期”50%）、11天（缩短“窗口期”50%）和59天（缩短“窗口期”89%）[8]。此外，NAT技术的灵敏度和特异性均显著的高于免疫学方法。尽管NAT技术从理论上并不能完全消除感染的“窗口期”，但通常在病毒核酸转阳之前的血液传染性很低，可以有效地预防经输血传播病毒性疾病。因此，在现有的科学技术条件下，NAT技术的引入可使输血传播病毒感染（Transfusion-transmitted viral infection，TTVI）的危险性降至最低。

日本是世界上最早在全国范围内对血液进行HBV、HCV、HIV NAT筛检的国家，德国和荷兰从1997年起就开始NAT筛检的尝试，英国和法国的部分血站也从2000年起开始了NAT血液筛检，美国则从1999年3月开始在FDA新药审核程序下使用不同的试剂进行常规血液筛检。纵观各国运用NAT进行血液筛检的情况，日本及欧美各国多采用以罗氏公司COBAS AmpliScreen系统及Chiron公司的TMA技术为基础的检测方法。各国根据自身特色，正在对各种不同的技术组合进行评估，目的是寻求一种最适合的NAT技术，既可以保障血液安全，又能保证血液的及时供给，还能做到省时省力。

我国血液制品技术管理部门从2002年开始，先后进行了原料血浆核酸检测的方法学研究和4万份取自不同地区样本的病原体筛查，并根据国家食品药品监管机构的要求拟定了相关的技术文件[9]。在血液制品原料血浆中开展NAT检测的相关法规已在酝酿和讨论之中。我国卫生部于2000年3月开始在12个省市的15个血液中心进行核酸检测试点工作，结果显示：试点后血液安全性大幅提高，效果非常显著。因此，卫生部、财政部联合下发文件，给予全国68个核酸实验室投入了1.57亿元用于核酸检测的培训和相关器械购买，使得血液核酸检测在更大范围开展，卫生部于2011年8月在哈尔滨召开的全国血液安全工作会议上，要求有条件采用核酸检测技术的省份尽量采用核酸检测方法。

2 NAT血筛试剂研发中应关注的几个问题

2.1灵敏度 迄今为止正式通过美国FDA认证可用于血液筛检的试剂仅有2种，即Roche COBAS AmpliScreen HBV/HCV/HIV和Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV检测系统。FDA评判这些试剂是否能用于血液筛检的标准之一：必须对50cp/mL的病毒核酸的检出率＞95%。相当一部分国产荧光定量PCR检测试剂或许能在某些标本上获得20cp/mL的灵敏度，但一般都很难满足95%检出低病毒载量标本的要求。2002年美国AABB年会上甚至有学者提出血液筛检试剂的灵敏度应该达到（5～6）cp/mL，才能保证不至于因为混合检测而造成的漏检，这无疑对血液筛检NAT试剂提出了更高的要求。

核酸筛查多为混样方式，由于在“窗口期”血液中HIV和HCV RNA的浓度比较高，这种混合检测的方法曾经，甚至是目前仍然被认为是提高血液安全的可接受的方案。但如果需要进行HBV DNA检测，为防止低拷贝的HBV病毒阳性血液漏检，混合样本数则不宜过大，应尽可能采用小样本数混合检测，甚至单人份检测。NAT检测最初在欧洲普遍流行96人份样本混合检测，随后逐渐更换成48人份、24人份混合[10]。Roche、Chiron新一代NAT检测系统的标准检测模式分别为6人份混合检测和单检。

2.2特异性 血液筛查对试剂的特异性要求较高，尽管目前应用于临床诊断的有些国产NAT试剂特异性已经很高，但考虑到血液筛查样本量大，容易因样本交叉污染、人工操作失误等因素导致假阳性出现，加上国产试剂、检测仪器的可靠性及稳定性较差，也难以确保检测结果的可靠性和准确性。目前，除了提高国产试剂的特异性之外，还必须要建立完善的检测程序。

2.3内标物 目前，我国诊断试剂生产企业生产的核酸检测试剂，多采用外对照作为PCR的质控，鲜有采用内对照的产品。但作为血源筛查的HIV、HCV RNA检测试剂，NAT检测试剂应有内标物。每个检测管都应有内标以保证阴性结果的可靠性，内标最好是在样品处理时即加入，这样能对样品处理至核酸扩增检测全过程进行监控；内标最好为RNA，便于对检测过程中是否出现模板RNA降解问题进行监控。

2.4全自动化操作 NAT操作步骤较复杂，影响因素较多，且对操作人员的技能要求较高。采用全自动核酸提取、扩增检测，能缩短检测时间，提高检测效率，便于质控，同时也有利于进行大样本量的筛查。Roche新一代检测系统COBAS S201 MPX System实现了在同一反应管中进行HIV/HCV/HBV 3项联合检测，实现了混样/加样、核酸提取、PCR扩增/检测的模块自动化；Chiron公司新一代检测体系PROCLEIX TIGRIS ULTRIO System在对单个标本进行筛查时，可以在单一的全自动设备（TIGRIS）上进行，此设备能完成样品抽提、扩增和检测全部工作。目前，我国核酸提取设备多为半自动化操作，提取效率较差，尚未在国内采供血机构广泛应用。因此，应该对核酸提取、扩增检测的整个流程进行优化，缩短检测时间，提高检测效率，建立一整套适合我国国情的血液核酸自动化提取、扩增检测系统。

我国现阶段除了引进成熟的NAT血筛技术外，还应提高国产核酸检测试剂的质量和自动化，完善国产血液NAT检测系统。这样不但可降低相应的检测费用，同时还更有利于新技术在国内的推广应用，进一步提高我国血液安全水平。总之，我国地域辽阔，经济发展水平、工作条件等相差较大，以何种具体形式开展血液NAT检测是一个需要深入探讨的问题。