邓守恒，柯贤柱，石小燕，蔡召忠，杨敬宁，黄永章，陈 萍

(1湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心，湖北十堰442000;2武汉市中心医院; 3湖北医药学院免疫教研室)

鸡贫血病毒(CAV)VP3基因是近年发现的凋亡诱导基因，可特异性地诱导人类多种肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无影响［1］，在肿瘤治疗中受到国内外研究者的关注。目前的研究多集中于VP3基因对肿瘤细胞的作用［2，3］，很少有VP3蛋白抗肿瘤作用的报道。2010～2011年，本研究采用靶向克隆法成功构建pET15b-VP3原核表达质粒，诱导表达并纯化VP3蛋白，为深入研究VP3蛋白的结构、功能、药理作用及临床应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 ①菌株、质粒和引物:PGEX-6P-1/TATVP3质粒(昆明医学院王剑松教授惠赠)，线性pET15b、大肠杆菌DH5a、E.coliRosetta(十堰市人民医院临床医学研究所提供)。PCR引物由上海生工公司合成。②试剂:限制性内切酶XhoⅠ、BamHⅠ(美国)，AdvantageR2 Polymerase Mix(大连)，DNA片段纯化试剂盒、200碱基对标准DNA(北京)。靶向克隆酶试剂盒(美国Loopile公司)，Ni2+-氮基三乙酸琼脂糖亲和层析柱(美国Bio公司)，Western blotting检测试剂盒(KPL公司)。③主要仪器:PCR仪(德国)，凝胶图像分析系仪(天呈科技公司)，凝胶电泳仪(大连)，核酸蛋白检测仪(上海)。

1.2 方法

1.2.1 pET15b-VP3重组质粒构建 以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板，利用引物进行PCR扩增。扩增条件:起始变性95℃1 min;然后95℃30 s、68℃3 min，35个循环;最后68℃延伸3 min。PCR产物电泳鉴定，低熔点琼脂糖凝胶电泳并回收纯化366 bp的VP3 cDNA片段，运用靶向克隆酶，将纯化后的VP3 cDNA与末端序列相同的线性pET15b进行同源重组，将连接产物转化至大肠杆菌DH5a，并涂布到含氨苄青霉素(100 μg/mL)的TB培养基上16 h，选单个菌落接种于含氨苄青霉素(100 μg/ mL)的TB培养基上培养24 h，少量提取质粒，通过XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定;然后将pET15b-VP3重组质粒送上海生工公司测序鉴定。……