薛园园,郭兴凤,程超男,吴欣欣

(河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450052)

风味蛋白酶水解豌豆蛋白的条件优化

薛园园,郭兴凤＊,程超男,吴欣欣

(河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450052)

对风味蛋白酶水解豌豆蛋白的条件进行了研究,在单因素试验的基础上,利用响应面分析法,优化蛋白酶水解豌豆蛋白的最佳条件为温度 48.8℃、pH6.2、酶与底物浓度比 (E/S)4%、底物浓度 6.34%、水解时间 3.9 h,最佳水解条件下的水解度为 14.55%.

风味蛋白酶;豌豆蛋白质;水解;响应面方法

0 前言

豌豆属豆科植物,在我国已有两千多年的栽培历史,现在各地均有栽培,主要产区有四川、河南、湖北、江苏、青海等十多个省区.为了生产高蛋白食品,豆类种籽蛋白的开发利用已引起世界各国的关注[1-2],豌豆也日益受到重视.豌豆的成熟种籽中含有 20%～30%的蛋白质,豌豆蛋白是一种优质蛋白质,氨基酸的比例较平衡,人体所需的8种必需氨基酸除蛋氨酸的含量较低外,其余均达到 FAO/WHO的推荐模式值[3-4].豌豆蛋白具有许多优良功能特性,如溶解性、凝胶形成性、乳化性、耐热耐盐性等[5].据报道,从豌豆中提纯的蛋白质水解物可以防治肾病和高血压,因此水解豌豆蛋白具有重要的研究价值.

植物蛋白水解物 (HVP)是一种营养型的食品添加剂,广泛应用于肉制品、方便面、膨化食品以及调味品中[6].水解植物蛋白的主要方法有酸水解、碱水解和酶水解.与酸、碱水解法相比较,酶法水解植物蛋白具有许多优点[7-8],因此,目前普遍采用的是酶水解方法.经过水解分离精制得到的多肽,具有高溶解性、高稳定性、高吸湿保湿性、抗凝胶性等特点[9-10],尤其是小分子肽,人体吸收速度快,利用率高,同时具有多种生物活性[11].目前,活性肽和蛋白水解的研究主要集中在大豆蛋白、乳蛋白、鱼蛋白方面,对豌豆蛋白的研究很少.作者研究了风味蛋白酶酶解豌豆蛋白的工艺参数,为进一步利用豌豆蛋白提供了基础数据.

1 材料和方法

1.1 主要原料和试剂

豌豆蛋白粉:蛋白质含量 67.38%,生产豌豆淀粉的副产物,山东健源食品有限公司;风味蛋白酶:活力 500 LAPU/g,Novo Nordisk;其他试剂均为分析纯.

1.2 主要设备

722S可见光分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;101型电热鼓风干燥箱:北京市永光明医疗仪器厂;CHA—S气浴恒温振荡器:金坛市华锋仪器有限公司;SHZ—88水浴恒温振荡器:江苏省金坛市医疗仪器厂;数显恒温水浴锅:北京中兴伟业仪器有限公司.

1.3 分析方法

1.3.1 豌豆蛋白粉中各组分的测定

粗蛋白含量的测定:GB/T5009.5-2003;水分的测定:GB/T5009.3-2003;灰分的测定:GB/T5009.4-2003;粗脂肪的测定:GB/T5009.6-2003;NSI值的测定:GB5511-85.

1.3.2 蛋白质水解度 (DH)的测定

茚三酮比色法[12].

1.3.3 酶水解豌豆蛋白的方法

称取一定量的豌豆蛋白粉,用磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液配成一定浓度的悬浮液,加入一定量的酶,将所得悬浮液放入设置不同温度的气浴恒温振荡器中振荡酶解,到所需反应时间后取出酶解液放在 90℃水浴中加热 10 min,灭活酶以终止反应,之后立即冷却至室温,将酶解液定容至100 mL,滤纸过滤,取上清液测定水解度,每个试验重复 2次,试验结果用平均值 ±偏差表示.

水解度的计算公式:

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验的基础上,以温度、pH值、底物浓度、加酶量 4个因素为自变量 (分别以 A、B、C、D表示),以水解度为响应值设计了 4因素 3水平共 21个试验点的响应面分析试验,因素水平的选取根据单因素试验确定.

2 结果与分析

2.1 豌豆蛋白粉的组成

豌豆蛋白粉的主要成分见表1.

表1 _豌豆蛋白粉的主要成分%

2.2 各因素对风味蛋白酶水解豌豆蛋白质水解度的影响

2.2.1 加酶量 (E/S)对水解度的影响

底物浓度为 5.0%,pH7.0,温度50.0℃,酶解时间 3.0 h,加酶量分别为 1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%.加酶量对水解度的影响如图 1所示.

图1 加酶量 (E/S)对水解度的影响

由图 1可以看出,随着加酶量的增加,水解度逐渐增加,最后趋于平缓,当加酶量为 4.0%时,水解度为 15.24%,当加酶量为 5.0%,水解度为16.56%,增加的幅度很小,这是因为加酶量在一定范围内,随着加酶量的提高,反应体系水解度逐渐上升,当加酶量超出一定范围后,由于酶浓度逐渐饱和,使酶解速度的增加趋于饱和[13],此时继续增大加酶量对反应速率无大的影响,因此选择加酶量 (E/S)在 4.0%左右对水解度进行考察.

2.2.2 酶解时间对水解度的影响

底物浓度为 5.0%,pH7.0,温度50.0℃,加酶量为 4.0%,酶解时间分别为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h.酶解时间对水解度的影响如图 2所示.

图2 水解时间对水解度的影响

由图 2可以看出,随着水解时间的延长,酶与底物作用充分,水解度逐渐增加,当达到 4 h后水解度变化趋于平缓.这是因为随着时间的继续增加,底物浓度减少,产物浓度增加,由于产物对酶的抑制作用,使得酶活力下降,从而导致水解度降低[14].综合考虑,水解时间选择 4.0 h.

2.2.3 底物浓度对水解度的影响

酶解时间为 4.0 h,pH7.0,温度 50.0℃,加酶量为 4.0%,底物浓度分别为4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%、9.0%、10.0%.底物浓度对水解度的影响如图 3所示.

图3 底物浓度对水解度的影响

由图 3可以看出,当底物浓度在 3.0%～6.0%之间时,水解度呈上升趋势,在 6.0%处最大,继续增大底物浓度,水解度呈下降趋势.因为当底物浓度较低时,酶分子与底物碰撞机会很大,反应较剧烈,随着底物浓度提高,体系底物浓度过大,溶液流动性下降,因此就降低了底物和蛋白酶的扩散和运动,使水解反应受到抑制[15],水解度逐渐下降,为了提高生产效率可适当增加底物浓度,底物浓度选择为 6.0%左右.

2.2.4 温度对水解度的影响

酶解时间为 4.0 h,pH7.0,底物浓度为6.0%,加酶量为 4.0%,温度分别为 40.0、45.0、50.0、55.0、60.0℃.水解温度对水解度的影响如图 4所示.

图4 水解温度对水解度的影响

温度对酶催化反应的影响有两个方面,一是温度升高会使反应速度加快,二是随着温度的升高,酶失活速度也加快,即通过减少有活性的酶降低酶的反应速度[16].在水解的最初阶段,第一个方面的影响占主导地位,水解度随着温度的升高而增加,但当温度高过最适温度的时候,第二个方面的影响占主导地位,水解度随着温度的升高而降低.在最适温度时,酶的活力最大[17],因此,最适的水解温度为 50.0℃.

2.2.5 pH对水解度的影响

酶解时间为 4.0 h,底物浓度为 6.0%,温度50.0℃,加酶量为 4.0%,pH分别为 5.0、5.6、6.2、6.8、7.4.pH对水解度的影响如图 5所示.

图5 pH对水解度的影响

由图 5可以看出,蛋白质的水解度随着 pH的升高先增大后减小,不同的酶最适 pH不同,在其最适 pH附近,酶的活力最大,与底物的作用最充分,水解度最大,在偏酸或者偏碱的环境中,由于酶部分变性而失活[18],因为 pH使得酶的空间结构遭到破坏,引起酶变性,从而导致酶构象的改变,酶活性随之丧失.因此,通过试验得出水解液较佳的 pH值为 6.8.

2.3 响应面设计与结果分析

响应面分析法 (response surface methodology,简称 RS M)是利用合理的试验设计并通过试验得到一定的数据,采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最优的工艺参数.

在单因素试验结果的基础上,固定加酶量4.0%,选取温度 (A)、pH(B)、底物浓度 (C)、时间 (D)为变量进行二次回归设计试验和分析.以豌豆蛋白质的水解度 (Y)为响应值设计了 4因素3水平共 21个试验点 (5个中心点).21个试验点可以分为两类:一为析因点,自变量取值在 4个因素所构成的三维顶点,共有 16个;二为中心点,中心点重复 5次,用以估计误差.试验方案及结果列于表2、表3中.

表2 响应面试验设计

表3 响应面试验结果

以水解度为响应值,经回归拟合后,各试验因子对响应值的影响可用二次方程表示:

运用 Design-Expert 6.0软件对 21个试验点的响应值进行回归分析,风味蛋白酶水解豌豆蛋白质的水解度回归方程的方差分析如表4所示,响应面分析图如图 6所示.

表4 响应面试验的 RS M方差分析

图6 各因素对水解度影响的响应面图

由表4可以看出,所建立的模型是显著的.在所选的试验条件下,因素对温度 (A)、pH(B)、时间 (D)、温度的二次项 (A2)、pH的二次项 (B2)影响更显著,底物浓度的二次项 (C2)影响显著,交互作用中 pH和酶解温度的交互作用 (AB)、底物浓度和 pH的交互作用 (BC)、底物浓度和时间交互作用(CD)影响显著.在因素水平的范围内,水解度随着温度、pH、底物浓度的升高先升高后降低,随着时间的增加水解度逐渐增加,最后趋于平缓.对回归方程进行偏微分,在试验范围内,进行适当调整,得出最佳的工艺条件为 pH 6.2,底物浓度 6.34%,加酶量 4.0%,温度 48.8℃,时间 3.9 h,水解度的预测值为 14.42%,而在此工艺条件下,做验证试验得到的豌豆蛋白的水解度为14.55% ±0.18%,响应值的试验值与回归方程的预测值吻合良好.

3 结论

以风味蛋白酶水解豌豆蛋白粉,响应面方法优化得到最佳的水解工艺为 pH 6.2、底物浓度6.34%、加酶量 4.0%、水解温度 48.8℃、水解时间 3.9 h,在此条件下豌豆蛋白的水解度预测值为14.55%.在最佳条件下进行水解,豌豆蛋白水解度得到了较大提高.

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OPTIM IZATION OF ENZY MATIC HYDROLYSIS COND ITI ONS OF PEA PROTEIN BY FLAVOURZY ME

XUE Yuan-yuan,GUO Xing-feng,CHENG Chao-nan,WU Xin-xin
(School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou450052,China)

The paper studied the enzymatic hydrolysis conditionsof pea protein by flavourzyme.On the basisof the single factor experi ments,we carried out the response surface method to opti mize the enzymatic hydrolysis conditions.The results showed that the opti mal enzymatic hydrolysis conditionswere as follows:reaction temperature 48.8℃,pH 6.2,the concentration ratio of enzyme to substrate 4%,substrate concentration 6.34%,and reaction time 3.9 hours;under optimal conditions,the degree of hydrolysis of pea protein was 14.55%.

flavourzyme;pea protein;hydrolysis;response surface method

TS201.2

B

1673-2383(2011)01-0005-05

2010-10-11

薛园园 (1985-),女,河南开封人,硕士研究生,主要从事植物蛋白的研究.

＊通信作者