魏 捷，蒋 华

器官培养保存法是目前国际上主要的角膜供体长期保存法，能保持角膜内皮细胞（corneal endothelial cells，CEC）活性长达 4周，不仅利于合理配置角膜资源，而且角膜抗原性也会随保存时间延长而逐渐减弱。研究认为，保存至3周时角膜片内的树突状细胞可完全消失[1]，可以降低免疫排斥反应发生率。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）因为营养成分丰富在器官培养保存法中应用广泛，但其批间变异大，成分不够清晰稳定，还有病原体污染风险。出于对人体安全性的长远考虑，有必要考虑自培养基中去除血清成分[2]。本实验拟对新型培养基－无动物成分培养基 （animal compound free medium，ACF）在无血清器官培养保存CEC活性方面的效果进行初步探索。

1 材料和方法

1.1 材料与动物分组 16只SPF级成年Wistar大鼠，体重200～250 g，雌雄不限，山东大学动物实验中心提供，过量麻醉处死，取双侧眼球。ACF购自美国Sciencell公司，MEM购自美国Gibco公司，葡聚糖T-500购自美国Pharmacia公司，兔多克隆抗ZO-1抗体购自Santa Cruz公司，SP-9000免疫组化染色试剂盒来自北京中杉金桥生物技术有限公司，RNA裂解液、总RNA提取试剂盒购自上海华美生物工程公司，TaKaRa试剂盒及DNA Marker由大连宝生物公司提供，引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。将角膜片随机分为2组，每组16只。对照组：角膜保存于MEM+2%FBS培养液中。试验组：即ACF组，角膜保存于无血清的ACF培养液中。

1.2 角膜器官培养保存方法 在超净台上按眼库标准无菌化程序处理。生理盐水冲洗眼球，再依序浸泡于0.5%碘伏溶液和含500 U/ml庆大霉素的乳酸林格液中，时间分别为2、20 min。剪下完整角膜片，角巩膜缘缝合1针后悬吊于20 ml培养液中，密封保存瓶口，置于31℃恒温箱中不换液保存4周。……