王晓慧 刘伟 李若瑜

(1.厦门大学附属中山医院皮肤科，厦门 361004;2.北京大学真菌和真菌病研究中心北京大学第一医院皮肤科真菌室，北京 100034)

双相真菌申克孢子丝菌 (Sporothrix schenckii)是孢子丝菌病的致病菌，主要引起皮肤及皮下组织感染，也可以引起黏膜、骨骼或系统性病变。近年来该菌引起播散型或系统性感染增多［1-2］，在免疫抑制患者尤其是艾滋病患者中发病率逐年增高［3-4］，逐渐受到重视。S.schenckii致病机

制至今尚不清楚，本研究采用简并PCR联合快速cDNA末端扩增 (rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术，成功克隆了S.schenckii过氧化氢酶(catalase，CAT)基因，命名为Sscat基因，为进一步探讨CAT在S.schenckii抗氧化防御机制中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

实验菌株为S.schenckiiBMU03906，分离自皮肤淋巴管型孢子丝菌病患者，北京大学真菌和真菌病研究中心保存菌种。该菌株经双相性及菌落形态鉴定后，分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)和脑心浸汁葡萄糖琼脂培养基在25℃和36℃保存。温度实验证实该菌株在37℃不生长，36℃可以生长。菌株在脑心浸汁血琼脂葡萄糖培养基36℃培养条件下，经过连续多次转种后培养出纯酵母相。实验前活化菌株。

1.2 试剂

LA Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、5'RACE和3'RACE试剂盒购自TaKaRa公司;纯化mRNA用Oligo dT纤维素购自Omega公司;以pBluescript SK(+)质粒为基础构建T-克隆载体，用于克隆PCR产物。

1.3 DNA，RNA提取及cDNA合成

将实验菌株接种于PDA斜面，25℃培养7 d，转种于脑心浸汁血琼脂葡萄糖培养基，36℃培养，每7～9 d转种1次以获得酵母相。收集酵母相菌体，用氯化苄法提取 DNA［5］。Trizol法提取总RNA，经Oligo dT纤维素柱纯化mRNA，逆转录合成第一链cDNA。

1.4 简并引物设计

在NCBI GenBank中寻找白念珠菌、新生隐球菌、荚膜组织孢浆菌、巴西副球孢子菌、裂殖酵母、枝孢霉以及构巢曲霉CAT的cDNA序列及氨基酸序列，经序列比对找出上、下游两段高度保守区(见图1)，设计简并引物 (见表1)。……