单增李斯特氏菌溶血素基因的克隆及原核表达
2011-09-11吴晓薇徐成刚马保华江经纬叶贺佳区燕宜徐小芹
吴晓薇 ，徐成刚 ，马保华 ，江经纬 ，叶贺佳 ，区燕宜 ，徐小芹 ，廖 明
（1.华南农业大学兽医学院，广东广州 510642；2.广东检验检疫技术中心，广东广州 510623；3.广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州 510642；4.南海出入境检验检疫局，广东佛山 528200）
单增李斯特菌是典型的胞内寄生菌，其感染过程包括内化、逃避液泡、吞噬、肌动纤维聚集和细胞传播等阶段，与各个阶段有关的毒力因子分别是InlA、hly、actA和plcB[7]。Hly基因是致病性李斯特氏菌重要的的毒力基因，hly基因编码形成李斯特菌溶血素O（Listeriolysin O，LLO）。目前的研究表明，LLO是一个多功能毒力因子，能引起宿主细胞多种反应，如细胞增殖、黏膜细胞外渗作用、巨噬细胞中细胞因子的表达、树突状细胞的凋亡、磷脂代谢及引起机体产生免疫反应等等[8-10]。LLO 是一种穿孔毒素，能损伤红细胞、巨噬细胞、裂解溶酶体膜和吞噬体膜，使细菌能够逃离噬菌体，从而逃避吞噬体中杀菌物质的杀灭，进入胞浆后在胞浆中复制。溶解素是细菌在胞液内繁殖的先决条件，其缺失将使细菌毒力全部丧失。不产生LLO的突变株虽可在非吞噬细胞的胞液中生存一段时间，但却不能繁殖，并因无法逃逸吞噬体而不能感染其他细胞。单增李斯特菌感染鼠脾脏和骨髓的树突状细胞后可导致细胞的凋亡；不产生LLO的李斯特菌突变体不能诱导细胞的凋亡，而提纯的LLO则可引起这种程序性控制的细胞死亡[8]。溶解素还在感染细胞内诱导信号传导和定向免疫应答中发挥重要作用[7]，它能够促进MHC-I类分子限制性免疫应答，增强保护性抗原的免疫作用[11]。由于LLO 所具有的独特生物学特性，已被用于构建各种减毒疫苗或核酸疫苗。LLO还可能成为一种新型的纯化蛋白抗原、脂质体、减毒菌株和DNA疫苗的递送工具[12]。
本研究旨在克隆和表达单增李斯特菌的Hly基因，探索大量制备溶解素蛋白的方法，为进一步研制基于溶解素蛋白的诊断抗原和特异性单克隆抗体，开展LM的致病与免疫机理研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒、酶及主要试剂
单增李斯特菌标准菌株LM-C53005购自中国药品生物制品监察所；菌株C53005为中国药品生物制品检定所购买，由华南农业大学禽病研究室保存；克隆载体质粒pMD18-T为大连宝生物工程有限公司产品；大肠杆菌表达载体质粒pET-28a、克隆菌DH5α 和 E.coli BL21（DE3）为 Novagen公司产品；Taq酶、各限制性内切酶及其他工具酶均为TaKaRa公司产品；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit I为OMEGA公司产品；丙烯酰胺（Acrylamide）、N-N'-亚甲叉双丙烯酰胺（Bisacrylamide）和琼脂粉为广州展晨生物技术公司产品；TEMED、过硫酸铵和IPTG为华美生物工程公司产品；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG为Sigma公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒为上海生工生物工程公司产品；兔抗单增李斯特菌血清由华南农业大学禽病研究室制备提供。
1.2 引物设计与合成
参考GenBank收录的单增李斯特菌Hly基因序列，使用 DNAstar（5.07版）和 Primer Premier（5.0版）软件进行分析，针对Hly基因的开放阅读框架（ORF）中不含信号肽编码序列的区域设计一对引物Hly1和Hly2，并分别在引物的5'端引入限制性内切酶BamHI和Xhol I的识别位点（下划线表示）。预期扩增产物跨幅为1515 bp。
Hly1：5'－GGATCCGATGCATCTGCATTCAAT AAAGA－3'，
Hly2：5'－GCGCCTCGAGTTATTCGATTGGAT TATCTAC－3'
引物送上海生物工程有限公司合成，用DEPC处理过的去离子水稀释为25 pmol/μL备用。
1.3 菌株DNA的提取
参照上海生工生物工程公司细菌基因组DNA提取试剂盒使用说明书进行。将菌株进行增菌培养，达到约109CFU/mL，10000 r/min离心1 min，去掉培养液。加入200 μL有溶菌酶的TE溶液，用移液器枪头混匀。在室温下酶解 8 min。加入 400 μL的Digestion Buffer，混匀；加入 3 μL 蛋白酶 K，混匀。在55℃的水浴保温5 min。加入260 μL无水乙醇，混匀，全部转移到套放于2 mL集管内的UNIQ-10柱中，8000 r/min离心1 min，弃去滤液，UNIQ-10柱用洗脱缓冲液洗涤三次；最后用40 μL洗脱缓冲液洗脱核酸，放置－20℃保存。
当t>x(0)/D0(x(0)
1.4 Hly基因片段的扩增
以提取LM DNA作为模板，用引物Hly1和Hly2进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃4 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，循环 30次；72℃10 min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。然后用小量凝胶回收试剂盒进行纯化回收。
1.5 Hly基因的克隆与序列测定
参照pMD18-T载体的使用说明进行，将纯化的Hly基因PCR产物与pMD18-T载体进行连接。连接产物转化到E.coli DH5a感受态细胞中，挑取白色菌落，用小量质粒提取试剂盒质粒DNA，阳性质粒命名为pMD18-T-sHly，对重组质粒进行PCR鉴定，酶切鉴定及测序。所测序列与GenBank收录的单增李斯特菌Hly基因序列进行BLAST比对。
1.6 重组表达质粒的构建
用BamHI和XholI分别双酶切重组表达质粒pMD18-T-sHly和pET-28a载体，产生相匹配的黏性末端，然后回收目的片段和载体片段，经T4DNA连接酶连接，构建重组表达质粒pET-28a-sHly。转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后，用小量质粒提取试剂盒提取质粒DNA，对重组质粒进行PCR及酶切鉴定。
1.7 Hly基因表达产物的SDS-PAGE分析
将转入pET-28a-Hly和pET-28a空载体的大肠杆菌BL21（DE3）分别接种于LB培养液后，于37℃振荡培养至OD600约等于0.5时，无菌条件下取1 mL菌液作为阴性对照。然后向剩余的培养液中加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养6 h，无菌条件下取1 mL菌液样本，10000 r/min离心1 min，取沉淀按照汪家政（2006）[13]的报道进行SDS-PAGE电泳检测。
1.8 表达产物的纯化
将携带表达质粒pET-28a-Hly的大肠杆菌BL21（DE3）接种于液体LB培养基中，37℃振荡培养至OD600约等于0.5时，用1 mmol/L IPTG诱导6 h，将菌体冷冻离心后弃上清，并重悬于细菌裂解缓冲液中超声裂解，表达产物作SDS-PAGE分析。12000 r/min离心后收集沉淀重悬于结合缓冲液中冰浴1 h，过Histrap Ni2+柱（Pharmacia），收集用洗脱缓冲液洗脱下的重组蛋白。
1.9 纯化蛋白的Western Blot分析
表达产物经SDS-PAGE分离后，电转移至硝酸纤维素膜，以兔抗单增李斯特菌血清为一抗，羊抗兔IgG-HRP标记抗体为二抗，进行Western Blot检测。
1.10 表达产物的可溶性分析
将1.4获得的携带表达质粒pET-28a-Hly的重组菌经IPTG诱导后，取100 mL培养液，4℃8000 r/min离心15 min，弃上清液；沉淀物用10 mL结合缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH7.6，20 mmol/L咪唑，0.5 mmol/LNaCl）重悬；超声裂解（60 W，2 min/次）10 min；将裂解物于4℃8000 r/min离心15 min，分别取适量上清和沉淀物按照1.7、1.9的方法进行SDSPAGE和Western Blot检测。
2 结果与分析
2.1 Hly基因PCR扩增结果
用引物Hly1/Hly2进行PCR扩增可得到约1500 bp特异性条带，与预期大小相符（图1）。
2.2 重组质粒pMD18-T-sHly的PCR检测、酶切鉴定及序列测定
将Hly基因PCR产物与pMD18-T载体进行连接（图2）。对重组质粒进行PCR及酶切鉴定（图3），并进行序列测定。
2.3 重组原核表达质粒的酶切鉴定、PCR检测及序列测定
用BamHI和XholI分别双酶切pMD18-T-sHly和pET-28a，经T4DNA连接酶连接，构建重组表达质粒pET-28a-sHly。对重组质粒进行PCR及酶切鉴定。重组质粒pET-28a-Hly用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切可以得到2690 bp左右的载体条带和1590 bp左右的目的条带，其大小分别与表达载体质粒pET-28a及sHly基因PCR产物的大小一致（图4、5）。
2.4 表达产物的SDS-PAGE分析
如图6所示，携带表达质粒pET-28a-Hly的大肠杆菌 BL21（DE3）经 IPTG（1mmol/L）诱导后，在 65 kU处形成一条特异的条带。
2.5 表达产物的Western-blotting鉴定
经Western-blotting鉴定可以得知，诱导表达产物可被兔抗LM阳性血清特异识别，如图7所示。表明单增李斯特菌的Hly基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到正确表达。
3 讨论与结论
本实验根据 GeneBank发表的LM的Hly全基因的末端保守序列设计游引物，采用 PCR方法扩增出标准株C53005溶血素基因，将其克隆到pMD18-T载体中，筛选带有插入片段的阳性质粒。经酶切和PCR鉴定，然后进行测序。结果显示，标准株C53005株Hly基因全长1590 bp，含有完整的开放阅读框架，编码529个氨基酸。其核苷酸序列与报道的EF183456和EQ8447148序列同源性分别为97.0%和99.9%，将其推导的氨基酸序列与报道的EF183456和EQ8447148序列推导的氨基酸序列进行同源性分别为98.0%和99.8%。
本研究以LM标准菌株LM-C53005为材料，克隆了不含信号肽编码区域的HlyA基因ORF部分，构建重组表达质粒pET-28a-Hly。成功的构建表达质粒后，诱导表达条件就直接影响实验的结果。诱导表达条件（如表达菌株、IPTG诱导浓度、大肠杆菌被诱导时所处的状态、诱导时间长短等）对于蛋白质的原核表达非常重要，本实验摸索了培养液中卡那霉素最佳浓度、培养液中的pH值、培养温度、诱导前的菌液状态、IPTG浓度等，结果证实：37℃培养，IPTG的终浓度1.0 mmol/L，诱导前的菌液OD600约为0.6，诱导时间约为5 h即可以得到较大表达蛋白的量。构建重组表达质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导成功表达HlyA基因。经Western-blotting鉴定，该蛋白具有良好的免疫学活性。
Hly基因编码529个氨基酸，蛋白质分子量约为58 kU。由计算得知，Hly基因表达的融合蛋白理论值应约为65 kU（表达载体pET-28a（+）的下游含有6个组氨酸（6×His）的纯化标签，重组蛋白融合着此6个组氨酸大小为6 kU）。SDS－PAGE分析结果表明：IPTG诱导后重组菌pET-sHly产生一条约60 kU的蛋白条。在 Western-blotting实验中用一抗是由本实验是自制的，采用LM的灭活苗三次免疫兔制备的多克隆抗体。经Western-blotting分析表明，表达的约60 kU重组蛋白处与LM全菌体免疫动物制备的多克隆抗体发生特异性反应，表明此重组融合蛋白与天然的LM溶血素蛋白一样都具有良好的抗原反应性。同时纯化后的Hly蛋白经Western-blotting分析表明，表达的重组蛋白带具有正常的反应原性。这说明重组蛋白可作为良好诊断抗原，也为单核细胞增生性李斯特菌快速诊断方法的建立提供了条件，为今后研制分子诊断试剂提供了科学的理论依据。另外，一抗、二抗浓度及反应条件也会直接影响Western-blotting特异蛋白带出现。本实验通过用Dot-ELISA的方法进行一抗、二抗浓度的摸索的得到一抗浓度1:50，二抗浓度为1:1000。由于LM溶解素蛋白在单核细胞增生性李斯特菌的致病和免疫方面也起着重要的作用，LLO蛋白的原核表达及其大量制备方法的探讨也为进一步开展LM的致病机理与免疫机理的研究奠定了基础。
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