许邹亮 ，南文龙 ，周 洁 ，陆明哲 ，郭玉广 ，谭鹏飞 ，毛开荣 ，彭大新 ，陈义平

（1.中国动物卫生与流行病学中心诊断液研究室，山东青岛 266032；2.扬州大学兽医学院，江苏扬州 2250093；3．中国兽医药品监察所，北京 10081）

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种人畜共患传染病，可引起流产、不孕和各种组织的局部病灶[1]。本病广泛分布于世界各地，家畜中牛、羊、猪最常发生，给畜牧业发展和人类健康都带来严重危害。近年来，我国人布鲁氏菌感染率呈现明显回升趋势[2-3]。

目前，布鲁氏菌病诊断技术主要有虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、乳环试验（MRT）、补体结合试验（CFT）、ELISA和PCR等方法[4]。2000年，Notomi等开发了环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），该方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势，并开始广泛应用于病毒病、细菌病、寄生虫病的诊断[5-7]。本研究建立了布鲁氏菌LAMP可视化快速检测方法，为基层简便、快捷临床检测布鲁氏菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Bst DNA聚合酶、AgeⅠ限制性内切酶购自New England Biolabs公司；甜菜碱、MgSO4、羟基萘酚蓝（HNB）、钙黄绿素和蛋白酶 K购自Sigma公司；dNTP、DL 2000 Marker等购自宝生物工程（大连）有限公司；QIAamp DNA Mini Kit购自QIAGEN公司；布鲁氏菌标准疫苗株S19、104M、M5和S2由本室保存；牛种布鲁氏菌544A（B.abortus 544A）、羊种布鲁氏菌16M（B.menlitensis 16M）、猪种布鲁氏菌S1330（B.suis 1330）、绵羊附睾种布鲁氏菌 63/290（B.ovis63/290）、 犬 种 布 鲁 氏 菌 RM6/66（B.canis RM6/66）由中国兽医药品监察所馈赠；猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等由本室分离保存；牛布鲁氏菌病RBT阳性血清样本采自布鲁氏菌流行区。

1.2 LAMP引物的设计与合成

根据GenBank中的布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因序列，利用PrimerExplorer V4设计一套LAMP引物，其中F3/B3为外引物，FIP/BIP为内引物，LF/LB为环引物；B4/B5为布鲁氏菌PCR检测引物[8-10]（表1）。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用ddH2O溶解后分装，-20℃冰箱保存备用。

表1 检测布鲁氏菌的引物序列

1.3 细菌基因组DNA的提取

从甘油葡萄糖琼脂平板上用0.5%的苯酚生理盐水将培养好的布鲁氏菌洗下，滤液放入70℃水浴锅灭活1 h。吸取600 μL的细菌培养物，5000 r/min离心5 min，弃上清。沉淀用540 μL的TE/sodium缓冲液重悬，然后加入 30 μL 10%（w/v）SDS、3 μL 2%（w/v）蛋白酶K，混合后37℃温育1 h。用酚氯仿对裂解细胞抽提2次，12000 r/min离心2 min，取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇，12000 r/min离心1 min，沉淀溶解在100 μL的TE缓冲液中。测定DNA模板浓度及纯度，-20℃冰箱保存备用。

1.4 LAMP反应体系的建立

优化反应条件，建立 25 μL 反应体系：2.5 μL 10×Thermopol buffer、4 μL MgSO4（50 mM）、1.5 μL dNTPs （25 mM）、4 μL 甜菜碱（5 M）、1 μL Bst DNA polymerase （8 U/μL）、1 μL F3/B3 （5 μM）、1.5 μL FIP/BIP（20 μM）、1 μL LF/LB（20 μM）、1 μL HNB（3 mmol/L）、2 μL Template DNA 和 3 μL ddH2O。63 ℃恒温反应60 min，反应结束后根据颜色变化观察结果。

1.5 LAMP产物的酶切鉴定

建立 25 μL 体系酶切体系：2.5 μL 10×NE Buffer、1 μL AgeⅠ内切酶、2 μL LAMP 反应产物、14.5 μL ddH2O，37 ℃反应 2 h，反应结束后取 5 μL 酶切产物电泳鉴定。

1.6 LAMP方法灵敏性检测

B.abortus 544A的基因组DNA模板经测定浓度后，进行10倍系列稀释，使得浓度梯度依次为85 ng/μL、8.5 ng/μL、850 pg/μL、85 pg/μL、8.5 pg/μL、850 fg/μL、85 fg/μL、8.5 fg/μL、850 ag/μL 和 85 ag/μL。分别取2.0 μL作为LAMP反应模板，每个梯度进行三个重复。反应结束后，直接肉眼观察反应管内颜色变化进行结果判定并通过电泳验证。

1.7 LAMP方法特异性检测

分别提取牛种布鲁氏菌544A、104M和 S19、羊种布鲁氏菌16M和M5、猪种布鲁氏菌S1330和S2、绵羊附睾种布鲁氏菌63/290、犬种布鲁氏菌RM6/66以及猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌的基因组DNA模板，进行LAMP扩增，检验LAMP方法的特异性，反应结束后直接肉眼观察反应管内颜色变化进行结果判定。

1.8 临床样本检测

按QIAamp DNA Mini Kit操作说明书分别从60份牛布鲁氏菌病RBT阳性血清样本中提取DNA，各取2 μL的DNA进行LAMP和B4/B5-PCR检测，比较两种检出方法的阳性检出率、符合率。PCR反应体系为 12.5 μL 2×Premix Taq Version 2.0，B4、B5（20 μM）各 0.5 μL 以及 2 μL 模板。PCR 反应程序是：先95℃解链 3 min；而后依次94℃20 s、60℃30 s、72℃30 s，共计 35 个循环；最后 72℃延伸 10 min。扩增产物通过1.5%凝胶电泳进行检测。

2 结果

2.1 LAMP产物的酶切鉴定

如图1所示，AgeⅠ特异性酶切后得到176 bp、218 bp和263 bp的条带，与理论分析相符，证明LAMP扩增片段特异。

2.2 LAMP可视化检测方法的灵敏性

将10倍递进稀释的B.abortus 544A的基因组DNA加入反应液中，于63℃恒温下反应60 min。结果如图2所示，发生LAMP扩增时，反应液变为天蓝色，未发生LAMP扩增的仍为紫色。取反应产物进行电泳，结果呈天蓝色的反应产物电泳时均出现阶梯状条带，表示出现LAMP扩增反应（图3），其颜色变化情况与电泳结果一致，可以判定本方法的检测极限约为17 fg。

2.3 LAMP可视化检测方法的特异性

对9株布鲁氏菌和4株阴性对照菌基因组DNA进行LAMP扩增，结果如图4所示，9株布鲁氏菌反应管均呈天蓝色，为阳性结果，4株阴性对照菌反应管均呈紫色，为阴性结果。

2.4 临床样本检测

用建立的LAMP可视化检测方法对60份RBT阳性的血清样本进行检测，并与B4/B5-PCR平行检测的结果进行比较。结果如表2所示，B4/B5-PCR检测为阳性的43份样品经本方法检测全部为阳性，B4/B5-PCR检测为阴性的17份样本，经本方法检测，其中9份为阳性，8份为阴性，两种方法的结果符合率为85.0%。

表2 临床检测结果（共60份阳性血清样本）

3 讨论

目前，在LAMP反应不开盖的前提下，其结果判定方式主要有目视检查浑浊、目视检查染料颜色变化和浊度仪对LAMP反应进行实时监控这三种方法[11]。目视检查浑浊法主要依据LAMP反应产生了大量的副产物焦磷酸镁白色沉淀而使反应液呈现浑浊，但是当浑浊度较低时，肉眼很难察觉。利用实时浊度仪能够更加直观、精确地判定结果，但是需要使用特定的仪器设备。相比较而言，染料比色分析既提高了肉眼的识别率，又可直接用于疫病的现场诊断，是最为简单方便的LAMP结果判定方式。目前，用于LAMP研究常见的染料主要有SYBR Green I、溴化乙锭（EB）、Picogreen、钙黄绿素和HNB等，其中以SYBR Green I和HNB的检测灵敏性最高，是钙黄绿素的10倍[12]。然而SYBR Green I需在LAMP反应结束后加入，增加了扩增产物污染的可能。本研究采用的HNB染料于反应前加入，稳定性好，且阴阳性结果颜色差别明显，易于判断。

LAMP方法是一种高灵敏性的检测方法，其灵敏性通常比PCR高出10～1000倍，达到甚至高于荧光定量PCR的检测水平[11，13]。在分析LAMP反应结果时，本试验采用HNB染料比色并进行电泳验证，两者结果一致，说明基于HNB染料的LAMP方法结果可信。本方法能检测到约17 fg布鲁氏菌基因组DNA，相当于5个布鲁氏菌基因组拷贝。另外，R.Ohtsuki等采用LAMP法，在BCSP31基因区段设计引物，也检测到10 fg的布鲁氏菌基因组DNA[13]，其结果与本研究相符。在进行特异性检测时，9株布鲁氏菌反应管全部从紫色变为天蓝色，而4株阴性对照菌反应管仍为紫色，显示本方法良好的特异性。将本方法与经典的B4/B5-PCR方法进行比较，对60份RBT阳性血清样本进行检测时，两者结果总符合率达85.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的43份样品经本方法检测全部为阳性；B4/B5-PCR检测为阴性的17份样本，经本方法检测，其中9份为阳性，8份为阴性。由于B4/B5-PCR的灵敏性通常在1 pg左右，可见本方法的灵敏性明显高于B4/B5-PCR。

本研究建立了布鲁氏菌LAMP可视化检测方法，整个反应在63℃恒温条件下进行60 min便能直接判定结果，简便易行，可用于基层对布鲁氏菌的快速检测。

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