鲁为山 李书军 刘彬 李洋 罗猛 孙丽亚 尤嘉琮 周清华

肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤，约占所有肿瘤的25%，且发病率呈上升趋势[1]。临床资料显示，多数患者在就诊时就已经有局部浸润和远处转移，在肿瘤完全切除之后仍出现肺癌的复发和转移。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，约占肺癌总数的80%-85%。因此，研究大细胞肺癌转移机制和早期分子标志，对于NSCLC的诊断及个体化治疗具有重要意义。

微小RNA（microRNAs, miRNAs）是一类非编码单链小RNA，长度约为21 nt-23 nt，通过与目标mRNAs互补配对导致mRNAs降解或抑制转录后翻译诱导基因沉默[2]。有研究[3-5]表明，体内可能存在与蛋白信号通路网络类似的miRNAs网络，而miRNAs网络与EMT过程、肿瘤血管生成、肿瘤转移的表观遗传修饰等过程有着密切的联系。因此，通过miRNA芯片筛选不同转移潜能人大细胞肺癌细胞株中转移相关miRNAs的差异表达，有助于进一步研究miRNAs在NSCLC侵袭转移中的分子机制，为阻断NSCLC侵袭转移的信号通道和逆转NSCLC侵袭转移表型提供新的靶点和途径。

1 材料与方法

1.1 细胞株 高转移人肺大细胞癌细胞株L9981和低转移人肺大细胞癌细胞株NL9980是周清华教授从人大细胞肺癌细胞系WCQH-9801母系细胞中分离建立起来的，它们具有相同遗传学背景、不同的侵袭能力和分子生物学特性[6,7]（由天津市肺癌研究所，天津市肺癌转移与肿瘤微环境重点实验室提供）。用含10%小牛血清（FBS,GIBCO）的RPMI1640（Invitrogen, Carlsbad, CA），置于37 °C、5%CO2孵箱中培养。

1.2 主要试剂 MiRNA Complete Labeling and Hyb Kit、Gene Expression Wash Buffer Kit和Human miRNA microarray购自Agilent公司，mirVana RNA Isolation Kit购自Ambion公司，RNase-Free DNase Set(50)购自Qiagen公司，反转录酶M-MLV Reverse Transcriptase购自Promega公司，RNA酶抑制剂购自Takara公司，荧光定量PCR试剂SYBR®RPremix Ex TaqTM购自Takara公司。……