石思恩 何泽锋 蔡建春 邱江锋

目前肺癌已经成为我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,大约70%的患者在诊断时已发展至晚期,无法通过手术治愈,故化疗成为肺癌综合治疗中的重要部分.但是肿瘤细胞对化疗药物发生耐药常导致化疗失败.近年来,人们对肿瘤细胞的耐药机制进行了深入的研究.我们前期的研究采用蛋白质组学方法,研究人肺腺癌细胞A549对顺铂发生耐药前后的蛋白质表达变化,观察到GRP75在耐药细胞中高表达[1].在本次研究中,我们通过慢病毒介导的RNA干扰技术沉默耐药细胞中GRP75基因的表达,观察干扰前后肿瘤细胞对顺铂敏感性的变化,探讨GRP75在肺癌细胞耐药机制中的作用,以期为肺癌的治疗发现新的靶点,为揭示肺癌的耐药机制提供线索,并为寻找逆转耐药途径提供基础.

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌细胞系A549购自中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC),A549/CDDP细胞为前期研究中诱导建立[1].主要试剂包括:HyQ RPMI-1640培养液(Sigma公司)、10%优级新生牛血清(Gibco公司)、GRP75 shRNA (h) Lentiviral Particles(Santa Cruz公司)、Control shRNA Lentiviral Particles(Santa Cruz公司)、Polybrene(Santa Cruz公司)、兔抗人GRP75多克隆抗体(Cell Signaling公司)、兔抗人bcl-2单克隆抗体(Cell Signaling公司)、兔抗人p53单克隆抗体(Cell Signaling公司)、兔抗人β-actin多克隆抗体(Cell Signaling公司)、胰蛋白酶(1:250,Gibco公司分装)、顺铂(CDDP,Sigma公司)、DMSO试剂级(Amresco公司)、噻唑蓝(Mtt,Ultra Pure Grade,Amresco公司)、碘化吡啶PI(Sigma公司)、Rnase(Sigma公司)、国产分析纯.主要仪器包括:SW-CJ-ZFD型双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)、Forma Series II Wcta Jacketed CO2Incubator水套培养箱(Thermo Electron Corporation)、DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精密实验设备有限公司)、高速离心机(日立公司)、荧光显微镜(奥林帕斯公司)、Touch Screen F039300酶标仪(Sunrise Remote).

1.2 方法

1.2.1 细……