洪学敏，周巧玲，唐 荣，何 楠，刘抗寒，杨敬华

（中南大学湘雅医院 肾内科，湖南 长沙 410008）

有关资料显示，近年来急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的发生率呈逐年升高趋势[1-3]。由于临床上缺乏可靠的早期肾损伤的诊断指标及除透析以外的有效治疗措施，其结果导致一部分AKI患者发展为多器官功能衰竭而死亡，另部分患者发展成为终末期肾脏疾病[4-6]。因此，早期发现和治疗AKI十分重要。本研究通过抗霉素A诱导的体外缺血再灌注（ischemia-reperfusion injury，IR）损伤模型，观察体外发生AKI时肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1，Kim-1）及NO水平的变化，并采用冬虫夏草制剂进行干预实验，旨在为进一步寻找早期诊断AKI的指标和积极治疗AKI提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM培养液（ScholarBio公司），胎牛血清（Medigenetic公司），抗霉素A（Sigma公司），Annexin V/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（晶美生物科技有限公司），NO试剂盒（南京建成生物科技有限公司），Kim-1 ELISA试剂盒（美国ADL公司），逆转录（RT）试剂盒（东洋纺上海生物科技有限公司），冬虫夏草原液（虫草制剂）由杭州中美华东制药有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 肾小管上皮细胞的培养 正常大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E，由中山大学医学院第一附属医院肾脏病研究所余学清教授惠赠，源于美国ATCC细胞库），在含10%胎牛血清的DMEM培养液，37℃、5% 二氧化碳条件下培养。

1.2.2 NRK-52E细胞活性测定（MTT法） 用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔4×104个细胞接种到96孔板，每孔总体积200μL，置37℃、5%二氧化碳培养箱中贴壁培养。在不同时间点（24、48和72 h）加入虫草制剂干预，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配）20μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。……