洪学敏，周巧玲，唐 荣，何 楠，刘抗寒，杨敬华

（中南大学湘雅医院 肾内科，湖南 长沙 410008）

有关资料显示，近年来急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的发生率呈逐年升高趋势[1-3]。由于临床上缺乏可靠的早期肾损伤的诊断指标及除透析以外的有效治疗措施，其结果导致一部分AKI患者发展为多器官功能衰竭而死亡，另部分患者发展成为终末期肾脏疾病[4-6]。因此，早期发现和治疗AKI十分重要。本研究通过抗霉素A诱导的体外缺血再灌注（ischemia-reperfusion injury，IR）损伤模型，观察体外发生AKI时肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1，Kim-1）及NO水平的变化，并采用冬虫夏草制剂进行干预实验，旨在为进一步寻找早期诊断AKI的指标和积极治疗AKI提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM培养液（ScholarBio公司），胎牛血清（Medigenetic公司），抗霉素A（Sigma公司），Annexin V/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（晶美生物科技有限公司），NO试剂盒（南京建成生物科技有限公司），Kim-1 ELISA试剂盒（美国ADL公司），逆转录（RT）试剂盒（东洋纺上海生物科技有限公司），冬虫夏草原液（虫草制剂）由杭州中美华东制药有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 肾小管上皮细胞的培养 正常大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E，由中山大学医学院第一附属医院肾脏病研究所余学清教授惠赠，源于美国ATCC细胞库），在含10%胎牛血清的DMEM培养液，37℃、5% 二氧化碳条件下培养。

1.2.2 NRK-52E细胞活性测定（MTT法） 用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔4×104个细胞接种到96孔板，每孔总体积200μL，置37℃、5%二氧化碳培养箱中贴壁培养。在不同时间点（24、48和72 h）加入虫草制剂干预，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配）20μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值（A值）。

1.2.3 实验分组 将第5代NRK-52E培养于含10%胎牛血清的DMEM中培养（37℃含5% 二氧化碳），待细胞生长至80%融合，无血清同步12 h后加入干预药物进行实验。设对照组（PBS）、模型组（抗霉素A）以及虫草干预组（虫草制剂）。设6个时间点：模型制备前（0/0 min）、抗霉素A干预终点（60/0 min）、恢复培养液培养后 10 min（60/10 min）、恢复培养液培养后30 min（60/30 min）、恢复培养液培养后60 min（60/60 min）、恢复培养液培养后120 min（60/120 min）进行实验观察。

1.2.4 体外缺血再灌注模型制备 将第5代NRK-52E培养于含10%胎牛血清的DMEM中培养（37℃含5% 二氧化碳），待细胞生长至80%融合，无血清同步12 h后进行各组实验。先去除含10%胎牛血清的DMEM培养液，温PBS洗两次，换上含10-10mol/L抗霉素A，1.5 mmol/L CaCl2和2 mmol/L MgCl2的PBS，在5% 二氧化碳，37℃条件下孵育60 min，60 min后更换含10%胎牛血清培养液，模拟体内再灌注过程。同时设立对照组，以不含抗霉素A的含1.5 mmol/L CaCl2和2 mmol/L MgCl2的PBS培养60 min作为对照组，而后用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行培养。用流式细胞仪检测二组实验前和再灌注60 min时的细胞凋亡率。

1.2.5 AnnexinV/PI染色流式细胞仪检测NRK-52E细胞凋亡 参照AnnexinV/PI染色凋亡检测试剂盒操作步骤进行，0.25%胰酶（不含EDTA）消化细胞成悬液后，1 000 r/min离心5 min，再以预冷的PBS洗涤细胞。重复离心1遍后，用1×Annexin V binding buffer悬浮细胞，调节其浓度为1×106/mL；取 100μL上述液体（1×105个细胞）置于 5 mL 试管；加 Annexin V-FITC、PI各 5μL，轻柔振荡细胞，室温下（25℃）避光孵育15 min；每管再加400μL 1×Annexin V binding buffer，1 h 内上机检测。Annexin-V+PI-被认为是早期凋亡细胞，Annexin-V+PI+是晚期凋亡细胞。Annexin-V-PI+为坏死细胞，Annexin-V-PI-为活细胞。细胞凋亡率=早期凋亡细胞数／所测细胞总数×100%。

1.2.6 细胞培养液上清NO的检测 收集两组不同实验时间的细胞培养液至离心管中，3 500 r/min离心15 min，-80℃冻存待测。严格按试剂盒说明操作，采用550 nm，0.5 cm光径，测各管的吸光度。并按试剂盒公式计算数值。

1.2.7 细胞培养液上清中Kim-1的检测（ELISA）同上收集细胞培养液上清样本。按ELISA试剂盒说明，依次按浓度次序分别加入50μL的标准品于空白微孔中。分别标记样品编号和空白孔，每组设5个复孔，严格按ELISA试剂盒说明进行操作，终止反应后，在450 nm的酶标仪上读取各孔的OD值，以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线，根据样品的OD值计算浓度值。

1.2.8 RT-PCR检测Kim-1 mRNA表达 采用Trizol一步法提取各组细胞RNA，测试管中分别加入引物 Kim-1（373 bp）：上游 5'-GGAGGAAATCTA GGTGTAG-3'，下游 5'-ATCTGGGTCCTTGCTCAG-3'；GAPDH（133 bp）：上游 5'-GACAACTTTGGCATCGTG GA-3'，下游 5'-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3'。按反应条件进行扩增：95℃预变性5 min，94℃变性40 s，54℃退火 35 s，72℃延伸 25 s，72℃终末延伸 7 min，共35循环，电泳后紫外灯下观察结果。mRNA半定量分析：将电泳后的凝胶放于Bandscan 510图像处理系统测量各自产物的光密度，读出Kim-1mRNA的相对值，进行统计学处理。

1.3 统计学处理

所有研究数据均采用SPSS 10.5软件包进行统计学处理，计量资料结果用均数士标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）及LSD-t检验，相关性采用Pearson直线相关性分析。以P＜0.05时认为差异有显著性。

2 结果

2.1 冬虫夏草制剂对NRK-52E细胞增殖的影响

预实验结果表1显示，5、10、20和40 mg/L冬虫夏草制剂对NRK-52E细胞增殖具有促进作用，其中以40 mg/L组尤为明显；而80 mg/L组开始NRK-52E细胞增殖率下降；从干预时间上看，在同一冬虫夏草制剂浓度干预实验时，72 h组较24 h与48 h组NRK-52E细胞增殖率高（均P＜0.05）。因此，本组研究选择40 mg/L冬虫夏草制剂和NRK-52E培养72 h为适宜的药物干预浓度及时间观察点。

表1 各组NRK-52E细胞增殖情况

2.2 各组NRK-52E细胞凋亡情况

图1显示，与对照组比较，各时间段和5种不同剂量虫草制剂组模型组的NRK-52E细胞凋亡率均显著升高，其中再灌注10 min时，NRK-52E细胞凋亡率即升高20.96%，随着再灌注时间延长，细胞凋亡更为明显，如再灌注1 h时细胞凋亡率为36.58%，再灌注2 h时46.73%。说明抗霉素A能成功诱导NRK-52E出现缺血再灌注损伤，在损伤过程中出现了明显的细胞凋亡，NRK-52E细胞凋亡率与再灌注时间呈一定的时间依赖性（均P＜0.05）。与模型组比较，虫草组NRK-52E细胞凋亡明显减少，且以再灌注30 min、1 h、2 h这3个时间点最为显著（均P＜0.05）。

2.3 各组NRK-52E细胞Kim-1水平的变化

表2结果显示，与对照组比较，模型组在缺血60 min时即出现Kim-1浓度显著增高，是缺血前的3.1倍，再灌注10 min时，Kim-1浓度逐渐增加，是缺血前的3.6倍，并随再灌注时间延长其浓度进行性增加，当再灌注2 h时是缺血前的4.8倍，各组间均差异有显著性（均P＜0.05）。而虫草组与模型组之间比较，无论在细胞缺血开始时还是再灌注10～120 min，各组Kim-1浓度在均较模型组低，两组之间差异有显著性（均P＜0.05）。

图1 各组NRK-52E细胞凋亡率 （n=5）

表2 不同时间点各组NRK-52E缺血再灌注时Kim-1水平的变化 （pmol/L，n=5）

表3 冬虫夏草对NRK-52E缺血再灌注时NO浓度的影响 （μmol/L，n=5）

2.4 各组NRK-52E细胞Kim-1 mRNA的变化

与对照组比较，模型组各时间点Kim-1 mRNA表达均明显上调（均P＜0.05）。与模型组比较，虫草组 Kim-1 mRNA 在再灌注 30 min、60 min、120 min时表达降低，且各个时间点差异有显著性（均P＜0.05），见图 2。

图2 各组NRK-52E细胞Kim-1 mRNA的表达 （n=5）

2.5 各组NRK-52E细胞NO浓度变化

与对照组比较，经抗霉素A组处理后，细胞培养上清中的NO浓度与缺血前比较，缺血60 min增加了大约2.04倍，再灌注10、30和60 min时，NO浓度较缺血前分别增加了2.3、2.8和3.2倍（均P＜0.05），当再灌注120 min NO含量出现了急剧下降，与对照组比较差异无显著性。与模型组比较，虫草组NO浓度较缺血前明显下降（均P＜0.05），见表3。

2.6 相关性分析

相关性分析显示，在NRK-52E细胞凋亡率升高的同时伴随Kim-1蛋白的高表达，且二者呈直线正相关（r=0.804，P＜0.01）。在 NRK-52E 细胞凋亡率明显升高的同时，NO浓度也显著升高，二者亦呈直线正相关（r=0.633，P＜0.05）。

3 讨论

Kim-1是一种新的Ⅰ型跨膜蛋白，它属于免疫球蛋白Ig基因超家族成员，主要在缺血及肾毒性损伤诱导时肾小管上皮细胞呈持续高表达，而在正常肾组织中仅有微弱表达[7-9]。本组实验中，经抗霉素A阻断细胞呼吸链诱导NRK-52E缺血，然后恢复普通培养基培养造成再灌注损伤时，NRK-52E出现明显的细胞凋亡，细胞上清液Kim-1浓度升高同时Kim-1 mRNA表达增强，且随再灌注时间延长Kim-1 mRNA表达逐渐增强，呈时间依赖关系。VAIDYA等[10]在缺血再灌注大鼠模型研究中发现，在双侧肾缺血10 min再灌注24 h即发现尿中Kim-1水平较基础控制水平增长了10倍，而且随着缺血时间延长，Kim-1表达持续增高，45 min组达到50倍；相比之下，同实验组大鼠血肌酐、尿素氮、尿蛋白排泄仅在缺血30 min、45 min时才有明显升高和肌酐清除率下降。他们认为高水平的Kim-1对于早期肾损伤的敏感性明显优于血肌酐、尿素氮、尿微量蛋白、尿NAG酶等传统诊断指标。此外，LIANGOS等[11]观察103例人的心肺手术后情况发现，31.00%的患者发生了AKI，这些确诊AKI病例患者的尿Kim-1浓度在术后2 h即增长了40.00%，术后24 h增长到100.00%，而血肌酐升高50.00%往往发生在术后1～3 d。另有学者[12]用免疫组化的方法，检测6例被肾活检证实肾小管坏死（ATN）患者的肾组织中Kim-1表达状态，同时还收集了32例患有急、慢性肾脏病患者的尿液，用ELISA试剂盒检测尿Kim-1的浓度。其结果发现，6例肾活检证实ATN的患者近端肾小管上皮细胞有广泛表达Kim-1，缺血性ATN患者尿Kim-1浓度明显高于其他急、慢性肾脏病患者，说明Kim-1在早期肾损伤诊断中意义的重要性。

一氧化氮（NO）是内源性血管舒张因子，与氧化应激关系密切。研究证实NO在肾缺血再灌注损伤中具有促进细胞凋亡作用[13]。本研究中，在NRK-52E细胞缺血损伤时NO浓度明显升高，随再灌注时间延长NO浓度逐渐增加，在再灌注60min时达到峰值，以后逐渐下降，但仍高于缺血前水平。本组对NRK-52E细胞缺血再灌注损伤时细胞凋亡与NO浓度变化进行了相关分析，发现二者呈直线正相关（r=0.633，P＜0.05）。此外，在细胞凋亡率升高的同时伴随着Kim-1蛋白的高表达，二者亦呈直线正相关关系（r=0.894，P＜0.01）。这提示AKI与氧化应激有关，当NRK-52E细胞处于缺血缺氧时很容易诱导Kim-1的产生和分泌。

冬虫夏草（Cordyceps Sinensis） 子在下调TGF-β、CTGF以及C-myc的表达，减轻糖尿病肾病大鼠的蛋白排泄及血肌酐水平，同时下调糖尿病肾病大鼠肾组织ColⅣ的表达，延缓肾小球硬化，并可防治环孢霉素肾毒性等方面的作用已得到肯定[14-16]。其能否调节AKI时Kim-1表达和NO水平不甚明了。与文献报道一致，我们发现冬虫夏草具有抗凋亡作用[17]。在本研究中，笔者采用40 mg/L浓度的虫草提取液对NRK-52E细胞的抗霉素A模型进行干预实验，发现冬虫夏草示出了较明显的细胞保护效应，表现为缺血再灌注损伤的NRK-52E细胞凋亡率的下降，Kim-1及NO表达的下调，并且以再灌注的30、60和120 min这3个时间点最为显著。这一结果表明，冬虫夏草对缺血再灌注损伤的NRK-52E具有良好的抗细胞凋亡作用，可能是通过下调Kim-1、NO的表达，减轻氧化应激而实现的。

总之，急性缺血再灌注损伤是AKI的主要病因，AKI时可启动细胞凋亡程序并可诱导氧化应激和Kim-1高表达，Kim-1能否成为AKI早期生物学标记物还需在人类的大样本研究中得到证实，同样冬虫夏草对AKI的肾保护作用机制还需进一步深入研究，本研究仅作为初探，为未来的深入研究奠定基础。

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