凌宏艳，胡 弼，庹勤慧，刘 刚，奉水东，朱炳阳，廖端芳

（1.南华大学医学院 生理学教研室，湖南 衡阳 421001；2.南华大学药物药理研究所 药理学教研室，湖南 衡阳 421001；3.南华大学公共卫生学院 流行病教研室，湖南 衡阳 421001；4.湖南中医药科大学药学院，湖南 长沙 410208）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一个全球性的和严重的慢性疾病，遗传和环境等因素的改变可导致T2DM的发生。T2DM发病机制的两个基本环节是胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和胰岛素分泌不足，其中，IR贯穿了T2DM发生发展的全过程[1]。因此，探讨IR发生的分子机制是控制和改善IR以及预防和治疗糖尿病等代谢综合征最根本的途径。微小 RNA（microRNA，miRNAs）是新近证明的一类高度保守的、内源性非蛋白编码的和长度为20～25 nt的小分子RNA，在转录后水平调节基因的表达[1]。近年来研究表明，miRNAs参与调控细胞的众多生物学过程，如脂肪细胞分化[2-4]、糖脂代谢[5]、能量的稳态[6]和胰岛素的产生和分泌[7-8]等，这些研究提示，miRNAs作为代谢性通路中新发现的调节因子，可能调节哺乳动物中与IR相关的代谢过程。因此，为探讨miRNAs在IR中的调控作用，本研究主要采用miRNAs芯片技术，分析比较了脂肪细胞和IR脂肪细胞中差异表达的miRNAs，筛选出与IR相关的miRNAs，并预测某些miRNAs可能调控的靶基因，为阐明IR的致病机制及其防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清均购于美国Gibco公司；分化诱导剂1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（1-methyl-3-isobuthylxanthine，IBMX）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、胰岛素和2-脱氧葡萄糖均购于美国Sigma公司；3T3-L1前脂肪细胞株购于美国ATCC公司；Trizol和实时定量PCR试剂盒购自Invitrogen公司；2-脱氧-[3H]-D葡萄糖购于Amersham公司，余为国产分析纯。

1.2 主要方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化 3T3-L1细胞以L-DMEM含10%新生小牛血清在37℃和5%二氧化碳的条件下培养。待细胞生长至完全融合后2 d（第0天）时开始诱导分化，将培养液换成含10%胎牛血 清、0.5 mmol/L IBMX、10μg/mL 胰岛素和1.0μmol/L Dex的L-DMEM刺激，2 d后换用只含10μg/mL胰岛素和10%胎牛血清的L-DMEM培养2 d，随后每2天换用含10%胎牛血清的L-DMEM，至第9天用显微镜观察。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测脂肪酸结合蛋白（adipocyte fatty acid binding protein 2，aP2）和过氧化物增殖体激活物受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）的表达 用Trizol提取总RNA，将1μg的总RNA逆转录成第1链cDNA，以第1链cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应引物如下：aP2：5'-CATGGCCAAGCCCAACAT-3'（正义），5'-CGCCCAGTTTGAAGGAAATC-3（'反义）；PPARγ：5'-CGCTGATGCACTGCCTATGA-3（'正义），5'-AGAGGTCCACAGAGCTGATTCC-3（'反义）；βactin：5'-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3'（正义），5'-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3（'反义）。荧光定量PCR的扩增参数如下：94℃预变性3 min；95℃变性 30 s、58℃复性 30 s、72℃延伸 40 s（45 个循环）；95℃ 1 min；55℃ 1 min；55℃ 10 s（80 个循环）；降温至4℃保存，得到荧光定量PCR的扩增动力曲线。根据LIVAK等[9]采用的FQ-RT-PCR的相对定量（2-ΔΔC）t方法，来比较目的基因在不同细胞中的表达差异。

1.2.3 3T3-Ll IR脂肪细胞的诱导 将6孔培养板中分化成熟的3T3-L1脂肪细胞用含5.5 mmol/L葡萄糖的10%胎牛血清培养2 d。为诱导IR，脂肪细胞分成两组：正常葡萄糖正常胰岛素组（对照组），用含5.5 mmol/L葡萄糖的10%胎牛血清DMEM培养液培养；高葡萄糖高胰岛素组（IR组），用25 mmol/L葡萄糖和高胰岛素液（1μmol/L）处理脂肪细胞24 h。

1.2.4 葡萄糖摄取实验 将6孔板中的脂肪细胞以含0.2%BSA的DMEM培养液培养2 h后，用KRPB缓冲液洗涤3遍，再以含或不含100 nmol/L胰岛素的KRPB缓冲液37℃孵育30 min，加入1 mL含 0.5μCi/mL 2-脱氧 -[3H]-D葡萄糖和 0.1 mmol/L 2-脱氧葡萄糖的KRPB缓冲液37℃孵育10 min。以10μmol/L的细胞松弛素B作为对照，计算细胞对标记葡萄糖的非特异性摄取。细胞用冰冷的含10 mmol/L葡萄糖的PBS快速洗3次终止反应，每孔加入1 mL 0.1 mol/L的NaOH作用20 min，取细胞消化液，加入到4 mL闪烁液中。在液体闪烁计数器中检测样品的每分钟衰变数，各数据均减去葡萄糖的非特异性摄取值作为各组细胞的葡萄糖摄取量，每次实验设3个复孔，共重复3次实验。

1.2.5 miRNA芯片分析 本实验将Trizol处理的3T3-L1脂肪细胞和IR脂肪细胞交至上海康成生物公司进行miRNA芯片杂交。基因表达谱芯片的检测步骤包括总RNA的提取与鉴定、miRNA标记和miRNA芯片杂交等步骤，最后芯片扫描获得TIFF图后，使用Genepix Pro6.0软件分析数据，以芯片中的内对照荧光值为参照，分别计算实验组和对照组的标准值；随后计算IR脂肪细胞中每一个miRNA的表达水平和脂肪细胞同一个miRNA的表达水平，两者之比即为改变的倍数。

1.2.6 生物信息学分析 根据基因芯片的结果，对显著变化的2个miRNAs进行分析，主要通过3个生物信息学预测网站（TargetScan、miRanda和miRBase），取至少2个软件预测到的基因作为靶基因。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS11.0软件包进行分析，以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化成成熟脂肪细胞

诱导分化前的3T3-L1前脂肪细胞形态与成纤维细胞相似，呈典型的梭形，胞浆中未见脂滴，见图1A；至诱导分化第9天时，90%以上的3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，表现为细胞浆丰富，大量的体积较大的脂滴分布于细胞核周围，形成“戒环样”结构，即为典型的成熟脂肪细胞形态，见图1B。荧光定量PCR结果显示：3T3-L1前脂肪细胞用分化诱导液处理后，aP2和PPARγ mRNA的表达水平显著升高，见图1C、D。

2.2 IR脂肪细胞模型的建立

图2显示，基础状态下，3T3-L1脂肪细胞经高葡萄糖和高胰岛素处理24 h后，葡萄糖摄取率无显著改变；而在胰岛素存在情况下，3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖摄取率明显增加，约为基础状态下的4.2倍；高葡萄糖和高胰岛素使3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取率由（419.0±19.2）%下降到（258.0±17.3）%（P＜0.01），提示高葡萄糖和高胰岛素联合培养脂肪细胞可诱导IR脂肪细胞模型成立。

图1 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化成成熟脂肪细胞

图2 高葡萄糖高胰岛素对3T3-L1脂肪细胞3H葡萄糖摄取的影响 （n=3）

2.3 miRNAs基因芯片杂交的结果

图3 miRNA表达谱代表图

来自3T3-L1脂肪细胞和IR脂肪细胞的总RNA经纯化和Cy3荧光标记后，同miRNA芯片进行杂交，使用Genepix 4000B在635 nm通道处对杂交后的芯片进行图像扫描，结果如图3所示。应用Genepix Pro 6.0软件分析所得数据，得到上调或下调超过2倍差异表达的miRNAs共79个：其中，表达水平降低50%以上者（表达下调）共29个，且miR-21下降最明显；表达水平升高2倍以上者（表达上调）共50个，且miR-320上调最明显。

2.4 靶基因的预测

本实验选择IR脂肪细胞中显著下调的miR-21和显著上调的miR-320进行靶基因预测。通过3个靶点预测软件（TargetScan、miRanda和miRBase）预测miR-21和miR-320可能的靶基因，为了减少假阳性率，挑选至少出现在2个软件中的基因作为其可能的靶基因。共筛选出与IR或糖尿病相关的靶基因13个，其中miR-21有7个；miR-320有6个。见附表。

附表 miR-21和miR-320与胰岛素抵抗或糖尿病相关的靶基因

3 讨论

研究表明，miRNAs表达的异常与IR和糖尿病密切相关。ESAU等[4]将反义miR-122注入小鼠体内导致血浆三酰甘油降低，进一步将小鼠的肝细胞取出培养发现，肝脏脂肪酸和固醇的合成减少，脂肪酸的氧化增加，表明miR-122调节小鼠的脂代谢。XU等[5]研究发现，miR-14缺失的果蝇体内三酰甘油和二酰甘油的水平提高，然而增加miR-14的表达则会产生相反的结果，说明miR-14是脂肪代谢的一个负性调控因子。TELEMAN等[7]报道，miR-278缺失的突变型果蝇有胰岛素生成增加、体重降低和血糖升高的变化；增加miR-278的表达可使上述指标得以恢复，这一实验首次表明改变体内miRNAs的表达对IR具有调节作用。WANG等[10]报道，miR-320可促进糖尿病大鼠的血管新生；HE等[11]发现，糖尿病小鼠的miR-29高度上调，将miR-29转染给3T3-L1细胞，可抑制胰岛素诱导的葡萄糖摄取。这些研究提示，miRNAs作为代谢性通路中新发现的调节因子，可能调节与IR相关的哺乳动物的代谢过程。如果能找到对IR调控的miRNAs，必将对IR和糖尿病等代谢相关性疾病的治疗提供一个新的基于RNA治疗的药物靶点。

3T3-L1脂肪细胞是来源于小鼠胚胎成纤维细胞、经克隆扩增而成的前脂肪细胞系，是在体外被广泛应用于脂肪细胞功能研究和IR发病机制研究的重要细胞模型。本实验通过经典的“鸡尾酒”法诱导3T3-L1脂肪细胞的形成，随后用高葡萄糖和高胰岛素处理脂肪细胞24 h，通过葡萄糖摄取实验进行验证。发现高葡萄糖和高胰岛素诱导脂肪细胞24 h，可明显抑制脂肪细胞对培养基中葡萄糖的摄取，提示高葡萄糖和高胰岛素可诱导脂肪细胞产生IR，从而为下一步的芯片实验奠定了基础。

miRNA芯片技术是一种快速有效地分析miRNA表达谱的方法，该方法可以更好地了解miRNAs的整体表达情况。本研究中，以miRNA芯片技术为平台，检测了脂肪细胞和IR脂肪细胞的miRNAs表达谱，筛选得到差异表达的miRNAs共79个：其中29个表达下调，且miR-21明显下降；50个表达上调，且miR-320明显上调。可见，在IR脂肪细胞中明显上调的miRNAs基因在数量上超过了在脂肪细胞中明显下调的miRNAs基因。

本研究采用的是丹麦Exiqon公司8.0版的小鼠miRNAs芯片。该芯片上固定的探针包括与人（328个）、小鼠（274个）和大鼠（238个）的miRNAs精确配对的探针、对照探针以及错配探针，可以检测Sanger miRBase数据库8.0版中所有已知的人、小鼠、大鼠和其他物种的miRNAs，代表性好；同时能够高灵敏和高特异性地检测miRNAs的表达，准确检测样品中所有miRNAs的表达水平；且每张芯片对同一样品重复4次检测，进一步提高了芯片的可靠性。因此，本研究筛选到的差异表达的miRNAs将为进一步研究miRNAs在IR形成中的调控作用提供了较多和较可靠的依据。

目前，在动物体内只有小部分miRNAs的生物学功能得到了阐明，绝大多数miRNAs的具体功能仍然不清楚，主要是由于在特定的状态下寻找miRNAs调控的靶基因存在一定的困难。生物信息学预测靶基因是miRNAs功能研究的重要方法，为此笔者对显著下调的miR-21和显著上调的miR-320进行靶基因预测，以求进一步理解他们与IR或糖尿病的关系。结果表明，miR-21的靶基因包括胰岛素信号相关基因PIK3R1和PPP1R3B、脂代谢相关基因PPARA以及细胞增殖相关基因TGFBI、TGFBR2、TIMP3和MAP3K1等；miR-320的靶基因主要为胰岛素信号相关基因 PTEN、PIK3R1、IGF2BP3、IGF1R和IGF1。上述结果提示这些miRNA的作用靶点广泛，涉及胰岛素的信号转导、脂代谢和细胞增殖等相关基因，由此说明：某些关键miRNAs表达水平的失衡可能是导致IR和糖尿病等代谢性疾病发生和发展的重要原因；同时也说明miRNA靶基因预测为进一步研究miRNA在IR和糖尿病发生中的作用机制提供了重要线索。

综上所述，本研究率先以miRNAs芯片技术对脂肪细胞和胰岛素抵抗脂肪细胞的miRNAs表达谱进行研究，经过分析比较发现29个下调和50个上调的miRNAs，靶点预测显示miR-21和miR-320的靶点非常广泛，为进一步研究它们的功能奠定了基础。

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