金光明，郑寿焕

（延边大学附属医院，吉林 延吉 133000）

CD14是革兰氏阴性细菌的细胞壁成分——脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的受体，主要表达在单核巨噬细胞表面，它可通过脂多糖结合蛋白（lipopolysaccha-ride binding protein，LBS）与 LPS 特异性结合，并通过Toll样受体-4以及MD2蛋白向下游传递活化信号，启动单核-巨噬细胞系统（mononuclearphagocyte system，MPS），并释放多种细胞因子，通过促进基底膜增厚、增加细胞外基质和加剧肾小球的硬化[1-3]等多种途径引起糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）的发生。而 CD14启动子-159存在（C-T）的基因多态性，可以直接造成蛋白质生物学性状的改变。为了探讨CD14启动子-159的（C-T）多态性对延边地区朝鲜族DN患者发病的影响，笔者开展了本研究。

1 材料与方法

1.1 对象

随机选取本院接待的朝鲜族健康体检者139名：男性99名、女性40名，平均年龄（60.5±9.7）岁作为正常对照组，临床和实验室检查均正常，排除肝、肾、内分泌和心脑血管疾病；选取2005年12月～2009年12月在本院内分泌科住院的朝鲜族DN患者152例：男性83例、女性69例，平均年龄（55.3±6.8）岁。DN的诊断标准为：尿白蛋白排泄率（Urinary albumin excretion rate，UAER）＞20μg/min的糖尿病患者。两组在年龄和性别间的比较差异无显著性。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 采用Promega公司生产的WizardRGenomicDNA Purification Kit提取DNA。取被检测对象肘静脉血3 mL到加有EDTA-Na2抗凝剂的真空采血管中，并立刻颠倒混匀。取300μL血样加入到1.5 mL Eppendorf离心管中，按照细胞裂解、核裂解、RNA去除、沉淀蛋白质、析出DNA、清洗DNA和水化DNA的过程分别加入试剂，进行DNA的提取。最后将所得的DNA经紫外分光光度计定量后于-70℃保存备用。

1.2.2 聚合酶链反应 所设计引物为：上游引物：5'-GCCTCTGACAGTTTATGTAATC-3'，下游引物：5'-GTGCCA ACAGATGAGGTTCAC-3'，由Promega公司合成。CD14的PCR扩增反应体系均为50μL，其中含 10×PCR缓冲液 5μL，2.5 mmol/L dNTP 5μL，上、下游引物各 1μL，模板 DNA 5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，不足体积用灭菌双蒸水补足至50μL。置热循环仪（TC-48/H型）中94℃预变性5 min；再按下列程序循环35次，即94℃变性60 s，57℃退火 45 s，72℃延伸 1 min；末次循环后，72℃延伸10 min。利用MegaBACE1000全自动毛细血管测序仪，由北京华美基因提供测序服务。

1.2.3 扩增产物的限制性酶切 取PCR扩增产物10μL，用5 u限制性内切酶 AvaⅡ（Promega公司）酶切CD14基因-159位点，37℃孵育2 h，反应终止后，消化片段在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，染色后经紫外灯判断结果并拍照。

1.2.4 DN患者各项生化指标的测定 所有参与者记录姓名、性别、年龄、病程、血压，并计算体重指数（body mass indes，BMI）。BMI= 体重（kg）/身高的平方（m2）。限制高脂肪、高蛋白饮食24 h。于次日清晨用强生SureStep Plus血糖仪检测空腹血糖及餐后2 h血糖；空腹抽取肘静脉血，一支分离血清用酶法测定生化指标：三酰甘油（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、 低 密 度 脂 蛋 白（low-density lipoprotein-cholestero，LDL-C）、血肌酐（creatinine，Cr）、C 反应蛋白 （C reaction protein，CRP），以上生化指标利用我院日立7600-101全自动生化分析仪检测（酶法）；另一支采用EDTA-Na2抗凝，0.5 mL采用微柱法测定糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，GHb）。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 11.5软件包进行分析。计数资料如基因型和等位基因频率采用直接计数法，各组间基因型及等位基因的频率比较采用四格表χ2检验，确定各基因型和等位基因频率已达Hardy-Weinberg平衡，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组间数据的比较依据资料的性质，采用t检验或方差分析。P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

经Hardy-Weinberg平衡定律检验，CD14启动子-159（C-T）基因型的分布符合遗传平衡定律，符合等位基因频率在不同种族人群中的分布。

2.1 CD14基因型分析

CD14 PCR扩增产物片段大小为497 bp，根据限制性内切酶AvaⅡ酶切片段的情况，基因型有3种，CC型（497 bp 1条带），CT型（497、353和144 bp 3条带），TT型（353和144 bp 2条带）（见图1）；测序结果表明该位点存在C-T的基因多态性（见图2）。

图1 CD14启动子-159位点基因型的5%琼脂糖凝胶电泳结果

图2 CD14启动子-159位点基因型测序图

2.2 正常朝鲜族对照组与朝鲜族DN组CD14基因多态性的比较

CD14启动子-159位点的基因多态性在朝鲜族正常对照组和朝鲜族DN患者中的分布差异无显著性（χ2=1.776，P＞0.05）；等位基因频率在两组人群中的分布也差异无显著性（χ2=0.309，P＞0.05）（见表 1）。

表1 正常朝鲜族对照组和朝鲜族DN组CD14启动子-159位点各基因型和等位基因频率分布 例（%）

2.3 朝鲜族男性与朝鲜族女性DN患者基因多态性分布的比较

表2 朝鲜族男性和女性DN患者CD14启动子-159位点CC基因型和CT+TT基因型分布比较 例（%）

将朝鲜族男性与朝鲜族女性DN患者中CD14启动子-159位点纯合子CC的基因频率与杂合子CT及纯合子TT基因频率相比，发现差异存在显著性（χ2=3.903，P＜0.05）（见表 2）。

2.4 对照组与DN患者各项临床指标的比较

两组之间病程、FBG、CRP和LDL-C比较，结果差异呈现显著性（P＜0.05或P＜0.01），与年龄、PBG、GHb、Cr、TC、TG、HDL-C 和 BMI无关（均P＞0.05）（见表 3）。

表3 正常对照组和DN患者临床生化指标 （±s）

表3 正常对照组和DN患者临床生化指标 （±s）

组别例数/n年龄/岁病程/年FBG/（mmol/L）PBG/（mmol/L）GHb/%Cr/（mmol/L）正常组 139 55.32±0.82 4.83±0.35 13.14±0.55 17.40±0.64 9.17±0.19 67.82±2.80 DN 152 54.37±1.23 10.46±0.771） 11.35±0.521） 17.66±0.83 10.67±1.02 105.37±10.13

续表3

3 讨论

目前国内多采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术研究CD14基因启动子-159位点的基因多态性。研究发现，不同人群和种族间CD14基因启动子-159位点基因多态性的CC基因频率分布有一定差异。在欧洲白种人中，希腊人CC基因频率最高（0.430）[4]，意大利人最低（0.270）[5]。亚洲人群如中国人、印度人和日本人之间CD14基因启动子-159位点的基因频率分布十分接近，但均与欧美和非洲国家人群之间存在明显差异。我国北方地区汉族人CC的基因频率明显低于德国人[6]、挪威人[7]、希腊人、捷克人[8]、以色列人[9]和意大利人。

本研究检测结果表明，CC基因的相对频率在朝鲜族对照组和朝鲜族DN组中分别为0.230和0.224，两组CD14基因启动子-159位点（C-T）基因多态性基因型和等位基因的频率分布无明显差异。CC基因的相对频率在朝鲜族男性和朝鲜族女性的DN患者中分别为0.319和0.181，两者之间存在明显差异。DN组的病程、FBG、CRP和LDL-C均高于对照组，提示以上因素在DN的发生中起一定的作用。

近年来，一些研究[10-11]表明，CD14启动子上游C-159T基因的多态性与冠心病、脑卒中等血管病变的发生关系密切，且这种相关性与种族相关，但有关CD14启动子-159位点（C-T）基因的多态性与糖尿病引起的微血管病变的报道仍然很少。本研究分析了139例朝鲜族健康对照组与152例朝鲜族DN患者CD14启动子-159位点（C-T）基因的多态性特点及其在延边地区朝鲜族中男性与女性之间的分布差异，结果示朝鲜族DN组中男性CC基因的频率明显高于女性，提示该等位基因可能与朝鲜族男性DN的发生有关。综上所述，可以初步得出：CD14启动子-159位点（C-T）基因的多态性虽然不是我区朝鲜族DN发生的主要遗传标志，但可能是朝鲜族男性DN患者发病的易感基因。

随着人类基因组计划的发展，人们已经认识到不同的基因背景可以造成不同人群对于某些疾病存在不同的易感性。研究不同基因型在人群中的分布，有助于从基因水平更深刻地阐明各种疾病在不同种族和不同性别人群中存在不同发病率和不同临床表现的内在机制。目前有关CD14启动子-159位点（C-T）基因的多态性与糖尿病血管并发症关联的研究已成为各个国家研究的热点，但是，不同群体所得到的关联程度也不一致。本研究结果证实CD14启动子-159位点（C-T）基因的变异在延边地区朝鲜族发病的男性中较高。不同基因变异在不同群体关联程度不一致的原因可能有以下几点：①不同的遗传背景和环境背景导致了不同群体和民族关联表现的不同；②不同研究者对于选择的患者采用的角度不同，如从糖尿病、冠心病、脑梗死等不同角度的研究；③当样本含量较小时，将实验所得出的肯定性结论应用于临床上时，其信息仍显不足[12]。

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