刘佩意，蒋卓勤，陈 相，冷 亮，马立丽

（中山大学公共卫生学院 营养学系，广东 广州 510080）

支气管哮喘（简称哮喘）是由多种细胞、细胞因子和炎症介质引起的气道慢性炎症性疾病。哮喘发病机制复杂，目前尚未完全明确。而哮喘高发于儿童，并且近年来儿童哮喘的发病率在逐年升高。随着对儿童哮喘关注的增加，幼年大鼠哮喘模型的研究也引起了学者的重视。虽然国内外哮喘大鼠模型的研究也很多，多使用SD和Wistar大鼠模型[1-2]，但幼年大鼠的哮喘模型却相对较少。故本实验综合了目前国内外比较常用的几种造模方法进行了实验和对比[3-4]，用不同剂量的卵清蛋白诱发幼年大鼠哮喘，比较不同剂量的致敏原对幼年大鼠哮喘的气道过敏性炎症的作用，为治疗和预防儿童哮喘的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

卵清蛋白（OVA，GradeⅡ，德国 Sigma公司）；氢氧化铝；细胞因子检测ELISA试剂盒（大鼠IL-4、OVA特异性IgE，德国Bender公司）；空气压缩式雾化器。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型 刚断乳的SPF级雄性Wistar大鼠（中山大学动物实验中心），平均体重（50±5）g。本学院SPF级动物房饲养，室温（25±3）℃，相对湿度40%～60%，每日人工照明12 h，无菌操作。大鼠按随机数字表法分为正常对照组、OVA低剂量组、OVA中剂量组和OVA高剂量组，每组8只，依据分组不同分笼饲养，可以自由进食不含特殊致敏原的纯净饲料和水。在饲养的第1天和第8天，低、中和高剂量组分别用 OVA（GradeⅡ）1 mg[5]、10 mg[6-7]和100 mg[8-9]+氢氧化铝100 mg+生理盐水1mL配制成混悬液在大鼠腹腔注射1 mL。对照组以生理盐水代替OVA致敏，腹腔注射生理盐水1 mL。在第15天，将低、中、高剂量组的大鼠置于20 cm×20 cm×30 cm大小的透明密闭容器内，由雾化器提供雾化动力，以5%OVA（GradeⅤ）进行雾化吸入激发，每次放4只大鼠，每次雾化30 min，连续6 d。正常对照组用生理盐水代替OVA激发。最后1次激发后24 h[5]，用50 g/L戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉动物，腹主动脉采血4～5 mL，静置2 h后3 000 r/min离心15 min，分离血清，于-80℃冰箱冻存备用。大鼠处死后打开胸腔，结扎左肺门，于右主支气管注入生理盐水3 mL行支气管肺泡灌洗（BAL）术，每次1 mL，反复抽吸3次，回收率约80%，对回收的支气管肺泡灌洗液（BALF）以1 500 r/min离心10 min，取上清液于-80℃冰箱保存，沉淀用1mL生理盐水打匀，进行细胞计数。取左肺靠近肺门处的肺组织用中性甲醛固定，进行病理组织切片，行苏木精-伊红（HE）染色，观察支气管肺组织病理改变。

1.2.2 BALF细胞计数 在光学显微镜下，用细胞计数板计数BALF中的细胞总数。

1.2.3 血清中IL-4和BALF中sIgE含量 以双抗体夹心ELISA法测定，具体步骤参照试剂盒说明书进行，根据标准曲线计算血清中IL-4和BALF中sIgE的含量。

1.2.4 肺组织病理分析 肺组织经梯度酒精脱水、石蜡包埋及切片后，进行HE染色。在光学显微镜下观察病理改变。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示。组间比较用单因素方差分析，两组间均数比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 大鼠行为学改变

低、中和高剂量组大鼠在雾化吸入OVA后5 min开始出现较明显的抓鼻动作，进而不同程度地出现呼吸增快、腹肌抽搐、四肢瘫软、行动迟滞、安静少动、反应迟钝和前肢缩抬，而高剂量组有的出现张口呼吸，并逐渐俯伏在一起，取出动物后可见遗留较多排泄物。对照组未出现上述表现，偶见抓鼻，并自始至终保持常态。

2.2 不同剂量OVA对气道炎症的影响

2.2.1 大鼠BALF中的细胞计数结果 与对照组比较，低、中剂量组BALF中细胞总数的差异无显著性，高剂量组明显增高（P＜0.05）；高剂量组较低、中剂量组明显增高（P＜0.05）；低剂量和中剂量组间差异无显著性（见表1）。

表1 BALF中细胞总数 （×106，±s）

表1 BALF中细胞总数 （×106，±s）

注：1）与高剂量组比较，差异有显著性，P＜0.05；2）与正常对照组比较，差异有显著性，P＜0.05

组别 n 细胞总数低剂量组 8 1.82±1.001）中剂量组 8 3.25±0.601）高剂量组 8 10.67±3.792）正常对照组 8 1.34±0.31 F值 38.091 P值 0.000

2.2.2 大鼠血清IL-4改变 与对照组相比，高剂量组大鼠外周血辅助性T淋巴细胞2（Th2）细胞因子IL-4升高，差异有显著性（P＜0.05），而与低、中剂量组的差异无显著性；高剂量组较低剂量和中剂量组IL-4也显著升高（P＜0.05）；低剂量和中剂量组比较，差异无显著性（见表2）。

表2 各组大鼠血清IL-4的比较 （±s）

表2 各组大鼠血清IL-4的比较 （±s）

注：1）与高剂量组比较，差异有显著性，P＜0.05；2）与正常对照组比较，差异有显著性，P＜0.05

组别nIL-4的浓度/（pg/mL）低剂量组 8 1.92±1.451）中剂量组 8 13.02±12.101）高剂量组 8 76.38±48.662）正常对照组 8 0.54±0.36 F值 16.522 P值 0.000

2.3 大鼠肺组织病理学改变

肺组织HE染色可见：正常组（附图A）的细小支气管和肺泡结构完整，细支气管腔和肺泡内未见炎性渗出，细支气管周围偶见炎症细胞；低剂量组（附图B）和中剂量组（附图C）的细支气管壁稍有增厚，但结构完整，细小支气管和血管周围可见中度炎性细胞浸润，细支气管和肺泡腔内无分泌物较少，中剂量组的支气管部分萎缩；高剂量组（附图D）的支气管明显萎缩，其上皮脱落并可见黏液栓，周围炎性细胞明显增多，血管周围淋巴组织增生，并伴有大量炎性细胞浸润，其中嗜酸粒细胞（eosinophils，EOS）明显增多。

2.4 大鼠BALF中sIgE水平

与正常对照组比较，中剂量和高剂量组大鼠的BALF中OVA特异性IgE明显升高，差异有显著性（P＜0.05），而低剂量组升高不明显，差异无显著性；高剂量组较低剂量和中剂量组大鼠BALF中的OVA-IgE也显著增高，差异有显著性（P＜0.05）；中、低剂量组间的差异也有显著性（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠BALF中OVA-IgE的比较 （±s）

表3 各组大鼠BALF中OVA-IgE的比较 （±s）

注：1）与高剂量组比较，差异有显著性，P＜0.05；2）与正常对照组比较，差异有显著性，P＜0.05

组别nOVA-IgE的浓度/（μg/mL）低剂量组 8 4.31±1.821）中剂量组 8 10.38±1.551）2）高剂量组 8 22.06±8.052）正常对照组 8 1.69±1.18 F值 36.531 P值 0.000

附图 各组大鼠肺组织病理性观察（HE，×400）

3 讨论

随着我国城市化进程的加速，目前哮喘已成为中国的第二大呼吸道疾病，并以儿童多发。婴幼儿哮喘的发病率也在逐年上升。虽然哮喘的具体发病机制还不是很清楚，但是目前大部分学者研究认为，TH亚群（Th1/Th2）比例失衡可能是哮喘发病中的一个重要环节或始动因素[10]。气道高反应（airway hyperresponsiveness，AHR）是哮喘的基本特征，气道慢性炎症是其基本病变，EOS在AHR和气道炎症中起核心作用，EOS浸润是气道病理改变的主要特征[11]。

哮喘病因复杂，动物模型种类繁多，使用哮喘动物模型进行实验时，应根据实验目的选择相应模型，使其尽量接近人类疾病。儿童过敏性支气管哮喘主要由吸入变应原引起，故本实验采用变应原结合免疫佐剂系统致敏后，再经气道给予同一变应原诱发哮喘的发生[12]。大鼠具有品系纯、繁殖快、价格低、来源及相关试剂较丰富、标本采集量大等特点，易产生迟发相哮喘反应，反应出现的时间与哮喘患者接近[13]，因而近年来大鼠模型的使用逐渐增多。而国内外制造大鼠哮喘模型时，大多是辅助注射了百日咳杆菌菌苗来加强致敏作用[14]。

幼年哮喘模型的大鼠都是刚出生的大鼠，由于幼年大鼠体重较轻，抵抗力较弱，体表面积小，笔者在其他实验中采用皮下多点注射操作显示易造成动物皮内肿块，致使动物死亡率增高，并且多点皮下注射易造成幼鼠感染，从而影响实验结果。因此，给幼年哮喘模型的建立造成了一些阻碍。SAKAI等[15]比较了不同剂量的致敏原对小鼠哮喘模型的影响，本实验参考了国内外多个实验方法[16-21]，建立了幼年大鼠哮喘模型，并探讨了不同剂量的致敏原造成哮喘的症状和表现的差异，希望摸索操作简单、稳定可重复的典型造模方法。实验结果表明高剂量组的大鼠采用第1天和第8天腹腔注射OVA 100 mg+氢氧化铝100 mg+生理盐水1mL混悬液，其血清特异性IgE增高较中、低剂量组最为显著；高剂量组大鼠的行为学表现异常，出现烦躁不安、呼吸增快、腹肌抽搐、大小便失禁等表现。肺组织病理切片可见支气管及血管周围大量炎性细胞浸润，肺间质和肺泡腔内可见EOS，支气管明显萎缩，管内可见黏液栓；血清IL-4升高，BALF中OVA特异性IgE升高，与国内外报道一致。而低剂量组和中剂量组血清IL-4不同程度升高，但与正常组相比差异无显著性，中剂量组BALF中OVA-IgE升高明显，与正常组比较差异有显著性（P＜0.05）。

本方法操作经济简便可行，剂量较易控制，为哮喘机制特别是气道炎症的研究提供了客观有效的手段。笔者成功建立了与人类哮喘病变相似的幼年大鼠过敏性支气管哮喘模型，比较了不同剂量的致敏原对哮喘发作的影响，为研究婴幼儿哮喘的发作提供了典型的动物模型，为探讨哮喘发病机制、筛选治疗药物提供了可靠的依据和途径。理想的哮喘动物模型应具备气道变应性炎症和气道高反应性两大特征[11]，但是本实验室目前不具备测定动物气道功能的设备和条件，仅能通过大鼠的症状表现和大鼠血清中特异性IgE来做推断，对于过敏性炎症与气道反应性的关系有待进一步研究。

[1]GAO WL,QIU C,YUAN QL,etal.Thepathmorphology changes on the reconstitution of airway in asthma rat model[J].Guangdong Medical Journal,2006,27(2):176-178.

[2]ZOSKY GR,SLY PD.Animal models of asthma[J].Clinical and Experimental Allergy,2007,37:973-988.

[3]YOUSEF A.TAHER,BETTY C.A.M.VAN ESCH,GERARD A.HOFMAN,et al.1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Potentiates the Bene?cial Effects of Allergen Immunotherapy in a Mouse Model of Allergic Asthma:Role for IL-10 and TGF-β[J].Journal of Immunology,2008,180:5211-5221.

[4]MASAO H,YUKO I,MASA-AKI S,et al.Mechanism of Inflammation in Marine Eosinophilic Myocarditis Produced by Adoptive Transfer with Ovalbumin Challenge[J].Int Arch Allergy Immunol,2007,142:28-39.

[5]迟 磊,符 州,戴继宏,等.过敏性哮喘大鼠模型的建立[J].重庆医学,2003,32(4):429-431.

[5]CHI L,FU Z,DAI JH,et al.The establishment of allergic asthma model of rat[J].Chongqing Medicine,2003,32(4):429-431.Chinese

[6]侯 敏,朱 明,马秀敏,等.维药神香草对哮喘大鼠血清白介素-17水平及Th1/Th2平衡的影响 [J].中国现代医学杂志,2010,20(3):365-368.

[6]HOU M,ZHU M,MA XM,et al.Effects of Uygur medicine Hyssopus officinalis L.on serum IL-17 level and balance of Th1/Th2 of asthma rats[J].China Journal of Modern Medicine,2010,20(3):365-368.Chinese.

[7]高亚东,熊盛道,徐勇健,等.一氧化氮对哮喘大鼠支气管平滑肌细胞钾通道的作用[J].中华结核和呼吸杂志,2003,10:615-618.

[7]GAO YD,XIONG SD,XU YJ,et al.The effect of nitric oxide on potassium channels of bronchial smooth muscle cells from asthmatic rats[J].Chinese Journal of Tuberculosis and Respiratory Diseases,2003,10:615-618.

[8] 王华光,张佳丽,王鹤尧,等.哮喘大鼠血清中 IL-4、IL-5、TNF-α和辅助性T淋巴细胞亚群的变化与哮喘关系的研究[J].中国现代医学杂志,2009,19(2):234-237.

[8]WANG HG,ZHANG JL,WANG HY,et al.Study on relationships between the changes of IL-4,IL-5,TNF-α,T-helper lymphocyte subsets in sera of asthmatic rats and bronchial asthma[J].China Journal of Modern Medicine,2009,19(2):234-237.Chinese

[9]王晓岩,迟宝荣,陈 漉.喘息康对支气管哮喘大鼠外周血浆IFN-γ、IL-5、Eos和Eotaxin的影响 [J].第四军医大学学报,2008,29(8):682-684.

[9]WANG XY,CHI BR,CHEN L.Effect of Chuangxikang decoction on peripheral plasma levers of IFN-γ,IL-5,Eos and eotaxin in bronchial asthma rat[J].Fourth Mil Med Univ,2008,29(8):682-684.Chinese

[10]MATHEU V,BACK O,MONDOC E,et al.Dual effects of vitamin D-induced alteration of TH1/TH2 cytokine expression:enhancing IgE production and decreasing airway eosinophilia in marine allergic airway disease[J].J Allergy Clin Immunol,2003,112:585-592.

[11]LIU CH,XUE QF,CHEN YZ.The research situation in the animal model of bronchial asthma[J].Chinese Journal of Tuberculosis and Respiratory Diseases,2000,23(11):647.

[12]SHI HZ.Correct understanding and rational application of the animal model of bronchial asthma[J].Chinese Journal of Tuberculosis and Respiratory Diseases,2005,28(11):749-750.

[13]ZHAO MH,ZHANG LF,ZHANG WP,et al.The quantitative study on airway inflammation of6asthma rat model[J].Journal of Zhejiang University,1997,26(3):100.

[14]LUO WL,LI HC,HAO HJ,et al.Effect of early exposure to allergen on rat asthmatic model[J].Journal of Peking University:Health Sciences,2006,38(2):159-163.

[15]SAKAI K,YOKOYAMA A,KOHNO N,et al.Effect of different sensitizing doses of antigen in a murine model of atopic asthma[J].Clin Exp Immunol,1999,118(1):9-15.

[16]WANG XF,HONG JG,ZHOU XJ.Vitamin D exacerbates airway inflammation in asthmatic rats[J].Shanghai Medical Journal,2008,31(1):27-29.

[17]LIGEIRO DE OLIVEIRA AP,DOMINGOS HV,CAVRIANI G,et al.Cellular recruitment and cytokine generation in a rat model of allergic lung inflammation are differentially modulated by progesterone and estradiol[J].Am J Physiol Cell Physiol,2007,293:1120-1128.

[18]LI CC,YE LP,CHEN XF,et al.Expression of signal transducer and activator of transcription 6 in rat asthma model and the modulatory effect of dexamethasone[J].Clin J Pediatr,2005,43(7):521-524.

[19]MARIE CJ,ANKE L,THOMAS T,REINHARD P.Kinetics of Regulatory T Cells in the Ovalbumin Asthma Model in the Rat[J].Int Arch Allergy Immunol,2009,149:16-24.

[20]ZHANG QL,ZHOU XJ,HONG JG.Effect of vitamin D supplementation in early life on airway hyperactivity and lung inflammation in rats with asthma[J].J Clin Pediatr,2009,27(5):476-479.

[21]MARIE CJ,ANKE L,THOMAS T,et al.Kinetics of regulatory T cells in the ovalbumin asthma model in the rat[J].Int Arch Allergy Immunol,2009,149:16-24.