陈 浩 ，王兴启 ，崔桂云 ，赵 辉 ，宋远见 ，高 丽 ，荆 佳 ，沈 霞

（1.徐州医学院附属医院 神经内科，江苏 徐州 221004；2.南京大学生命科学学院，江苏 南京 210093；3.徐州市中心医院 神经内科，江苏 徐州 221009；4.徐州医学院 神经生物学教研室，江苏 徐州 221004；5.南京医科大学附属脑科医院 神经内科，江苏 南京 210029）

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是神经科常见的急、危、重症，其发病率、致残率及死亡率均很高，严重威胁着人类健康。研究证实Hb与出血后脑损伤密切相关，作为Hb的分解代谢限速酶HO-1对疾病的发展具有重要影响。研究证实，诱导HO-1高表达可减轻神经细胞损伤而过高表达却会进一步加重神经细胞损伤[1-2]。已有实验证实3～30μmol/L Hb诱导的HO-1对星形胶质细胞具有保护作用[3]，那么更高浓度的Hb诱导的HO-1对星形胶质细胞的作用却未见相关报道。故本实验将选择更高浓度的 Hb（40μmol/L）诱导 HO-1表达，观察 HO-1对体外培养的星形胶质细胞的影响，研究结果将为进一步了解Hb诱导的HO-1在出血性脑疾病中的作用提供新观点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SD大鼠（1 d），由徐州医学院实验动物中心提供。高糖DMEM培养基购于GIBCO公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；HO-1羊多克隆抗体购于Santa Cruz公司；Hb、ZnPPIX、β-actin 兔单克隆抗体、Bax小鼠单克隆抗体、Bcl-2兔单克隆抗体、p-JNK小鼠单克隆抗体及JNK兔单克隆抗体购于Cell Signal公司；GFAP兔单克隆抗体购于博士德公司；CCK-8购于日本同仁公司；Hoechst 33342试剂盒购于碧云天生物技术公司；RT-PCR试剂盒购于天根生物公司。

1.2 星形胶质细胞培养及鉴定

参照DALLAS等[4]的方法，取新生24 h内的SD大鼠，超净台内无菌条件下断头取脑分离出大脑皮层剪碎，胰酶消化、离心、吹打及过滤后，接种于培养瓶内，放入37℃，5%二氧化碳饱和湿度培养箱内培养。5～7 d传代1次，传到第3代时，采用GFAP对细胞进行鉴定。

1.3 分组

实验分为3组，对照组（Control组，简写：C组）：仅用DMEM培养基；Hb组：含有40 μmol/L Hb的DMEM培养基及Hb+ZnPPIX组（简写：HZ组）。10 μmol/L ZnPPIX预孵育2 h，吸出后再加入含40 μmol/L Hb的DMEM培养基。Hb作用时间为6 h。

1.4 Hoechst 33342细胞核染色

将第3代星形胶质细胞种于24孔板内，干预处理后，用预冷的PBS漂洗后加入预冷的4%多聚甲醛，加200μL/孔的Hoechst 33342染色液，室温放置3～5 min，吸尽Hoechst 33342染色液，PBS漂洗，选用340 nm的激发光观察。在20×10倍下每组至少选择4个视野计数细胞凋亡率，并且避开培养孔的四周区域。

1.5 CCK-8测定细胞存活率

将星形胶质细胞种于96孔板，干预处理，同时设一空白对照组（未进行任何处理），阴性对照组（不加CCK-8），其他实验组用灭菌的PBS漂洗1遍，每孔加 100μL的 DMEM培养基后再加入 10μL CCK-8溶液，细胞培养箱内孵育4 h，酶标仪450 nm下测各孔吸光度。

1.6 Western blot检测 HO-1、Bax和Bcl-2的表达

取等量蛋白样品加入10%SDS-PAGE分离后，以半干转法转至NC膜上，加入脱脂牛奶室温摇床封闭2 h；分别加入稀释的一抗，4℃过夜；次日洗脱缓冲液洗膜，分别加入相应二抗室温孵育2 h，洗膜；BCIP/NBT显色后条带经图像处理仪进行激光扫描、定量分析及打印。蛋白激活水平以免疫印迹中相应条带的灰度值相对于内参组的比值来表示。

1.7RT-PCR检测HO-1的mRNA

按上述分组处理完毕后，参照总RNA抽提说明书对总RNA进行抽提，逆转录及聚合酶链反应。HO-1的上下游引物：5'-ACGGCCCTGGAAGAGGA-GATAG-3'和5'-GAGTGTTCATGCGAGCACGATAG-3'（PCR条件：退火温度60℃，30个循环）；β-actin上下游引物：5'-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3'和 5'-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3'（PCR 条件：退火温度60℃，30个循环）。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电泳后，将凝胶放于Tanon凝胶成像分析系统分析。

1.8 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件包进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 星形胶质细胞鉴定结果

星形胶质细胞传代至第3代时应用GFAP抗体免疫荧光鉴定，阳性率达97%，结果说明绝大多数细胞为星形胶质细胞。见图1。

图1 星形胶质细胞鉴定结果（GFAP标记，×200）

图2 RT-PCR及Western blot法检测HO-1的mRNA及蛋白表达变化

2.2 Western blot及RT-PCR法检测HO-1的变化

Western blot及RT-PCR技术检测各组HO-1蛋白及mRNA的表达情况，每组分别重复3次后进行数据统计，分析结果显示：Hb组、HZ组与C组相比，HO-1蛋白及其mRNA表达量明显增多，P＜0.001差异有显著性；HZ和Hb相比，HO-1表达降低，但P＞0.05差异无显著性。见图2。

2.3 Hoechst 33342核染色观察细胞损伤

分析结果说明：Hb组、HZ组和C相比，细胞凋亡率明显升高，P＜0.001差异有显著性；HZ组和Hb相比，细胞凋亡率显著降低，P＜0.01差异有显著性。见图3和附表。

附表 各组Hoechst 33342核浓染率及CCK-8检测细胞存活率的比较 %

2.4 CCK-8检测细胞存活率

CCK-8检测结果示：Hb组、HZ组和C相比，细胞存活率明显降低，P＜0.001差异有显著性；HZ和Hb相比，细胞存活率明显提高，P＜0.01差异有显著性。见附表。

图3 Hoechst 33342核染色观察各组细胞损伤情况

2.5 Western blot进一步检测 Bcl-2、Bax及p-JNK的变化情况

图4 Western blot检测各组p-JNK、JNK、Bcl-2和Bax变化情况

结果显示：Hb组、HZ组与C组相比，Bcl-2/Bax的比值下降，而p-JNK/JNK比值上升，P＜0.01差异都有显著性；HZ组与Hb相比，Bcl-2/Bax的比值上升，而p-JNK/JNK比值下降，P＜0.05差异都有显著性。见图4。

3 讨论

Hb约占成熟红细胞蛋白总量的95.00%，ICH发生时红细胞裂解释放出大量的Hb，而Hb会进一步分解产生大量血红素。因此，将导致出血周围神经组织暴露于血红素中。ICH导致的脑损伤主要是由氧化应激反应和炎症反应等引起的，而Hb代谢产生的血红素是ICH脑损伤中过氧化剂和自由基的重要来源。血红素可以被其分解代谢限速酶血红素氧合酶继续分解代谢为铁、一氧化碳及胆绿素。目前发现HO存在 3种同工酶：HO-1、HO-2和HO-3。HO-1又称热休克蛋白-32，为可诱导型，可被多种因素如重金属、热休克、缺血-再灌注、缺氧、高氧和Hb等诱导表达；HO-2及HO-3为原生型在体内持续表达[5]。虽然HO-1可以分解代谢血红素降低其对神经系统的损伤作用，但目前有关HO-1在神经细胞损伤或保护中的作用却存在着争议[1-2]，这主要与HO-1被诱导表达的水平情况有很大关系。MOON等研究发现梓实糖苷能通过诱导Neuro-2a高表达HO-1抵抗过氧化氢的损伤[6]；然而又有研究证实HO-1能够加重ICH发生后早期脑损伤[2]。那么不同浓度的Hb诱导的HO-1对星形胶质细胞的作用如何呢？RAYMOND F.REGAN发现3～30 μmol/L Hb诱导的HO-1对星形胶质细胞损伤具有保护作用，但本实验进一步研究发现40 μmol/L Hb诱导的HO-1对离体星形胶质细胞却有损伤作用。

在本研究中星形胶质细胞的损伤是否与HO-1过高表达有关，笔者采用了HO的活性抑制剂ZnPPIX抑制HO-1的活性，观察星形胶质细胞的损伤情况。值得注意的是，大量的研究已经证实ZnPPIX对HO-1的表达没有影响但对HO-1的活性有很强的抑制作用[7]。本实验结果显示ZnPPIX可减轻40μmol/L Hb对星形胶质细胞的损伤作用。

为观察40μmol/L Hb诱导的HO-1对星形胶质细胞的作用，本组通过RT-PCR及Western blot检测HO-1的mRNA及蛋白表达量并利用CCK-8及Hoechst 33342核染色检测细胞活力变化及细胞核浓染情况。结果显示当HO-1蛋白被诱导过高表达时，星形胶质细胞有明显损伤发生，而ZnPPIX作用后损伤明显减轻。研究发现JNK、Bcl-2和Bax等蛋白参与多种细胞的存活或凋亡过程，且目前已有大量研究证实它们也与神经细胞的存活或凋亡有关系[8]。Bcl-2和Bax二者含量和功能状态之间的平衡是调控细胞凋亡的重要机制。研究认为在一定范围内，Bcl-2/Bax的比值增高时对细胞有保护作用，但比值减小时则对细胞有损伤作用[9-10]。JNK被磷酸化激活后可促进Bax的表达而下调Bcl-2，从而促进细胞凋亡[11]。本实验Western blot结果显示当HO-1蛋白被诱导过高表达时p-JNK/JNK的比值明显升高，Bcl-2/Bax的比值则明显下降；而ZnPPIX作用后p-JNK/JNK的比值降低，而Bcl-2/Bax的比值则明显上升。Western blot结果与CCK-8及Hoechst 33342检测结果一致。以上结果说明，40μmol/L Hb作用于星形胶质细胞后HO-1的表达水平过高，进而降低细胞存活率，提高JNK磷酸化水平及降低Bcl-2/Bax比值，增加细胞核浓染率促进细胞凋亡。

综上所述，本实验说明40μmol/L Hb诱导的HO-1对星形胶质细胞具有损伤作用，此研究结果丰富了对HO-1在Hb导致的星形胶质细胞损伤中的认识。此外，本研究结果也进一步解释了HO-1能够加重ICH发生后脑损伤的原因，这可能是病人发生ICH后出血周围脑组织中HO-1的表达量已超过其具有神经保护作用的水平而处于过高表达状态，其后果会加重神经组织中如星形胶质细胞的损伤。以上认识将对ICH发生后脑损伤的有效防治提供相关理论依据。

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