覃志坚,龙显科,王俊利,何印蕾,常正义

(右江民族医学院,广西 百色市 533000）

地中海贫血是一种常见的遗传性血液病之一,其特点是因珠蛋白基因突变使血红蛋白中珠蛋白链合成障碍,导致血红蛋白成分组成结构发生改变,临床上以慢性进行性溶血性贫血为主要表现。大部分患儿因输血并发症或严重贫血死于成年之前,目前全世界已发现了200余种β珠蛋白基因突变类型,中国人中发现了30种[1]。百色是β-地中海贫血病的高发地区,孕妇检出率达6.74%[2],其基因类型及频率分布具有明显的地域及民族差异,本文对百色地区右江流域世居壮族进行了β-地中海贫血的研究,从596例壮族地贫基因携带者中进行β珠蛋白基因类型及频率分布分析。

1 材料与方法

1.1 研究对象

为右江医学院附属医院检验科2005年至2010年间当地壮族就诊者,经抗碱血红蛋白(HbF）和血红蛋白A(HbA）定量测定筛查检出596名地贫基因携带者.男275名,女321名.年龄1d-75岁。祖籍及民族通婚情况均为纯正壮族样本。

1.2 实验材料

1.2.1 仪器 实时荧光PCR分析系统由匹基生物公司提供;β-地中海贫血芯片检测阅读系统亚能生物有限公司提供。

1.2.2 试剂 PCR试剂盒及反向点杂交(RDB）β-地中海贫血的基因诊断试剂盒由亚能生物有限公司提供。按操作说明书进行。

1.3 实验方法

1.3.1 血液标本的采集和保存 抽取静脉血5 ml,EDTA-Na2抗凝,分离血浆与血细胞,-85℃存放。

1.3.2 β地中海贫血初筛 用醋纤薄膜对血红蛋白液进行电泳分离、721分光光度计比色测定HbA2含量,用抗碱法测定HbF含量。[3]

1.3.3 外周血DNA提取 筛查出的阳性标本按常规的酚—氯仿抽提法提取DNA。

1.3.4 β珠蛋白基因突变分析[4]PCR扩增β珠蛋白基因:引物的5末端用生物素标记.与酶标抗生物素蛋白相结合作为检测信号。长片段引物:Long fragment primer 600 bp扩增片段Amplified fragment,C1:5′-GTA CGG CTG TCA TCA CTT AGA CCT CA-3′,C2:5′-TGC AGC TTG TCA CAG TGC AGC TCA CT-3′,短片段引物:Interest paragraph primer 200 bp扩增片段 Amplified fragment,D5:5′-CAA TGT ATC ATG CCT CTT TGC A-3′,D6:5′-GAA TAA TCC AGC CTT ATC CCA A-3′

(1）基因组DNA提取:柠檬酸钠抗凝全血2 ml,分离血浆与血细胞,-85℃存放,外周血DNA提取筛查出的阳性标本采用常规酚—氯仿抽提法抽提基因组DNA。(2）基因组DNAPCR:分别加入45 μ l PCR反应混合物至含有扩增所需的DNA多聚酶各管中;吸取2 μ l处理样本上清液至PCR反应管中,混匀,5 000 r/min离心30 s。按下列参数进行PCR反应:94℃5 min(94℃60 s,55℃30 s,72℃60 s）×35个循环,72℃5 min。(3）杂交[5,6].取15 ml塑料离心管,编号,放入同样标有编号的膜条,加入A液(2×SSC,0.1%SDS,pH 7.4）12ml,加入1支PCR产物,拧上离心管盖。沸水中加热10 min,取出,放入42℃杂交箱或水浴箱杂交(杂交时间应长于2 h）,同时取1只50 ml塑料管,加入40 ml B液(0.5×SSC,0.1%SDS,pH 7.4）,拧紧盖子,一并置于42℃杂交箱或水浴箱中进行预热(至少0.5 h）。(4）洗膜取出膜条,移至装有预热B液的50 ml管中,于42℃轻摇洗涤30 min(每管40 ml溶液）。(5）显色:用镊子小心取出膜条,用A液在平皿中室温轻摇洗膜2次,每次5 min,再用C液(柠檬酸钠14.7 g溶于450 ml纯净水,用盐酸调pH值至5.0,最后定容至500 ml）室温轻摇洗膜2次,每次2 min,将膜条浸泡于显色液中避光显色约10 min,将显色的膜条在纯水中快速漂洗1次,进行结果判定。(6）杂交结果判定:正常的PCR扩增产物只与正常寡核苷酸探针杂交,只在正常探针位置出现荧光信号,突变的杂合子则与正常和相应的突变探针杂交,在正常探针及突变探针位置均出现荧光信号,突变的纯合子或双重杂合子只与相应的突变探针杂交,在相应的突变探针位置出现荧光信号。

检测中国人7个常见β-地中海贫血基因突变位点:CD41-42(-TCTT）,IVS-Ⅱ-654(C→T）,CD17(A→T）,-28(A →G）,CD71-72(+A）,CD17/-29。(6）结果判断观察膜条上出现的蓝色斑点,在野生型探针相应的位点出现蓝色斑点即为该位点的基因突变[7]。

2 结果

596例β-地贫携带者中,常见的基因突变位点为CD17 49.33%(294/596,其中纯合子14例,杂合子206例,双杂74例）;CD41-42 34.06%(203/596,其中纯合子11例,杂合子130例,双杂62例）;IVS-Ⅱ-654 8.39%(50/596,其中纯合子1例,杂合子29例 ,双杂 20例）;βE 8.05%(48/596,其中 βE杂合子32例 ,双杂16 例）;CD71-72 4.36%(26/596,其中杂合子19例,双杂7例）;-28 4.36%(26/596,其中杂合子16例,双杂10例）;CD17/CD-29 0.17%(1/596）。频率最高为CD17,其次为CD41-42,结果见表1。

表1 β-地中海贫血基因突变纯合子、杂合子分布频率[例(%）]

3 讨论

地中海贫血是一种遗传病,目前尚无良好的根治办法,当患者严重贫血时,只能依赖长期输血和合理的除铁方法维持生命,给家庭和社会造成极大的负担。百色市地处广西西部,人口378.8万人(2006年统计）,壮族约占总人口的80%,瑶族、苗族、回族、彝族、仡佬族约占 6%。百色地区β-地中海贫血突变频率与广西省已有的研究资料接近,从地理分布上看广西不同地区的β-地中海贫血基因型及其发病率多有差异.百色地区以CDl7最常见,其余地区则是CD4l-42最多见[8].吴惠珍等对百色市孕妇地中海贫血的筛查结果显示,α-和β-地贫的总携带率为18.15%,其中α-地中海贫血杂合子为 11.41%,β-地中海贫血为6.74%。与报道的广西南宁地区及柳州市随机人群筛查的结果近似,比广东省高[2]

本研究运用基因芯片技术,完成了596例壮族人群β-地贫基因携带者的珠蛋白基因突变分析,共检测到7种常见突变类型。频率最高为CD17,其次为CD41-42,有别于作者前一研究论文结果(CD41-42 46.20%、CD17 29.35%）[3],因前一篇论文研究对象为整个区域,不分民族,本文主要对象为壮族人群,与王报道的相符[8]。吴晓黎等[9]对贵州省苗族、水族、瑶族中的基因突变型特点、基因型频率及分布规律研究中发现,受检2566人群中,共检出134例β-地中海贫血携带者,总检出率为51.22%,其中苗族、水族、瑶族检出率分别为41.72%,61.06%,41.45%。经β珠蛋白突变基因分析,在这3个民族中仅检出两种中国人常见突变型CD41-42和CD17,检出率分别为88.11%,60.10%,23%。单可人等研究结果也显示侗族人群中只检出CD17(77%）、CD41-42(23%）两种基因突变类型,而在土家族人群中检出 CD17(23.1%）、CD41-42(69.2%）、却有别于贵阳地区和前人报道的贵州β-地中海贫血基因突变类型情况[10],李毅等在瑶族同胞β-地中海贫血受检的26例携带者中,经PCR-RDB检出CD41-42突变1例、CD17突变6例,结论为荔波瑶族人群中β珠蛋白基因变异情况很单一,很有自己独特的特点[11]。提示基因突变类型具有显著的民族特征。

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