刘红敏,陈旭东,华新宇

(漯河医学高等专科学校组织胚胎学教研室,河南漯河 462002）

近年来虽然胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓基质细胞治疗神经系统病变已取了成绩,但胚胎干细胞和神经干细胞取材难,且有伦理方面和移植后易形成瘤的困扰,而骨髓基质细胞要跨胚层分化且取材时对机体损伤大,对神经系统疾病的临床治疗也不尽人意。近年来研究证明人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAECs）具有部分胚胎干细胞特性[1-2],可分化为3个胚层不同类型的细胞[3-6],诱导剂和方法被认为是关键因素。本实验比较了两种化学诱导剂诱导人羊膜细胞向神经细胞方向分化的情况,以寻求一种较为理想的诱导剂及方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MEM培养基购自(美国Gibico公司）;人羊膜上皮细胞WISH细胞株购于中国科学院上海生命科学研究所;小鼠抗人NSE、GFAP单克隆抗体、兔抗鼠SP-Kit检测试剂盒、DAB显色试剂盒(棕黄色）均购于北京中杉金桥生物工程公司;胎牛血清(购自杭州四季青生物工程材料有限公司）;碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF）、全反式维甲酸(alltransretinoic acid,ATRA）、丁酸羟基茴香醚(butyl hydroxy anisd,BHA）、胰酶购于sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 预诱导液和诱导液的配制 以含10%胎牛血清和10 μ g/L碱性成纤维细胞生长因子的MEM培养基作为预诱导液;以含1 μ mol/L全反式维甲酸和无血清的的MEM培养基作为一种诱导液;以200 μ mol/L丁酸羟基茴香醚和无血清的MEM培养基作为另一种诱导液。

1.2.2 细胞的准备 人羊膜WISH细胞悬于10%胎牛血清的MEM 培养基,按2×104个/ml接种于25 ml培养瓶中,置37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。24 h换液后,除去未贴壁的细胞和残渣。倒置显微镜下观察,待细胞生长至80%融合时用0.25%胰酶消化传代准备诱导。

1.2.3 人羊膜上皮细胞诱导分化 预诱导hAECs按2×105个/ml密度接种于预先置6孔板中制备细胞爬片,每孔加含10%胎牛血清的MEM培养基培养,待细胞80%融合时,吸去孔中的培养液。将细胞分为3组,第一组为对照组,加入等量的含血清MEM培养基,第二组为全反式维甲酸诱导组加入预诱导液(10%胎牛血清+10 μ g/L碱性成纤维细胞生长因子+MEM培养基）,第三组为丁酸羟基茴香醚诱导组加入预诱导液(10%胎牛血清+10 μ g/L碱性成纤维细胞生长因子+1 mmol/L巯基乙醇+MEM培养基）,三组培养24 h。吸弃孔中液体后用D-Hank,s液洗两次,ATRA诱导组加入含1 μ mol/L全反式维甲酸和无血清的的MEM培养基进行培养,BHA诱导组加入含200 μ mol/L丁酸羟基茴香醚和无血清的MEM培养基进行培养,对照组为等量的无血清MEM培养基进行培养,倒置相差显微镜下观察。

1.2.4 免疫细胞化学检测 诱导12 h后的细胞用0.1 MPBS洗涤2次后,用4%多聚甲醛固定30 min,用0.1%TritonX-100作用10 min,0.1M PBS洗3次,余下步骤按免疫组织化学染色试剂盒说明操作(SP法）。一抗为1∶100小鼠抗人神经元烯醇化酶(NSE）单克隆抗体和1∶100小鼠抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP）单克隆抗体。DAB显色,光镜观察,随机取10个不同视野(×100）,计算神经元样细胞占总细胞的比例,结果用(¯x±s）表示。以PBS为一抗作阴性对照。

1.2.5 统计学处理 各组间比较用方差分析,两两比较用LSD法检验。采用SPSS15.0软件包完成数据分析(P＜0.05）。

2 结果

2.1 倒置相差显微镜下观察细胞形态

hAECs经预诱导液作用24 h后,无明显形态变化。ATRA组加入诱导液ATRA后,2 h后开始发生形态变化,hAECs的胞体向内收缩,呈球形或锥形,并向周围长出较长的突起,12 h后部分细胞出现双极或多极的细胞突起,少数细胞突起末端还出现分支,转变为类似神经元的形态,24 h后神经元样细胞未见明显增多,但少量细胞突起连接成网状,诱导48 h后,神经元样细胞逐渐萎缩;而BHA组加入诱导液后,细胞生长速度较ATRA组慢,细胞形态几乎无发生改变,对照组细胞一直保持宽大的多边形状态,细胞无明显增殖。3 d后见到不少漂浮的细胞。

2.2 诱导分化细胞免疫细胞化学显色鉴定(图1）

对照组细胞形态仍然呈宽大多边形NSE阳性细胞,诱导12 h后,ATRA组NSE免疫组化显示阳性细胞胞质着色染为棕黄色,胞核不着色,BHA组细胞NSE阳性细胞胞质着色染为棕黄色。诱导组和对照组GFAP染色基本无阳性细胞显示。

2.3 统计学分析结果

每组随机选取10个视野,统计分析阳性细胞率差异具有显著性(表1）,其中以ATRA组阳性率最高,对照组阳性率最低。

3 讨论

目前人羊膜上皮细胞向神经细胞方向分化诱导、调控方面的研究很少,人羊膜WISH细胞来源于正常足月妊娠的人羊膜上皮细胞,对研究人羊膜上皮细胞的生物学特性有重要作用[7]。也是体外研究羊膜上皮细胞的生物特性及其功能调节的有效实验模型。

表1 三组NSE、GFAP阳性细胞百分比例值(±s）%

表1 三组NSE、GFAP阳性细胞百分比例值(±s）%

P＜0.05

组别 NSE GFAP对照组 (38.43±1.61） 0 ATRA组 (91.86±2.62） 0 BHA 组 (63.12±1.25） 0

蔡哲[8]等研究表明羊膜组织中存在神经干细胞特异性标记蛋白Nestin表达阳性细胞,而且其中存在已分化的神经元和胶质细胞。ATRA是一种强烈的神经分化诱导剂,目前应用全反式维甲酸诱导胚胎干细胞或骨髓基质细胞向神经元分化研究较多,在本研究当中,ATRA诱导人羊膜上皮细胞12小时后大部分hAECs可转变为神经元样细胞,并有双极和多极突起的出现,诱导24 h后一些神经元之间可形成网状,结合免疫细胞化学染色结果,诱导12 h时,ATRA诱导组大部分细胞呈NSE阳性,NSE是神经细胞的特异性标志物,与Strbing等用ATRA处理胚胎干细胞后几乎全部细胞分化成神经细胞的结果一致,同一时段,出现形态变化的hAECs数量与NSE阳性细胞数量基本一样,提示形态和表型在诱导过程中都发生了明显的变化,提示hAECs在ATRA诱导下,不仅从形态上,而且在分子水平上皆有向神经元样细胞分化的改变。BHA和巯基乙醇均为强的抗氧化剂,BHA的抗氧化作用更强,常用作神经细胞诱导剂[9],本研究中BHA组阳性率低于ATRA诱导组但高于对照组,且BHA组NSE阳性细胞形态并未发生明显变化。三组中GFAP标志物均呈阴性,说明诱导分化出的细胞不是神经胶质细胞。但诱导后的细胞是否具有神经细胞的生理功能,成为真正意义上的神经细胞,能否合成分泌神经递质,与其他细胞和组织建立突触联系,传递和接受神经冲动从而具有神经细胞的生理功能,还有待进一步深入研究。

血清会增加培养基的复杂性,抑制细胞分化[10],因此本实验采用无血清的MEM培养基进行诱导,以更有效促进hAECs分化;3 d后倒置显微镜下见到部分细胞漂浮,可能与诱导液中缺乏血清营养有关。

从发育生物学角度来讲,人羊膜上皮细胞源于外胚层成羊膜细胞,保持着早期外胚层细胞的多潜能特性,而神经元也来源于外胚层,分化无需跨胚层,此外,人羊膜上皮细胞源于大量被遗弃的胎盘,是再生医学中没有争议的细胞来源,因此人羊膜上皮细胞可作为移植的前体细胞来源。hAECs向神经元样细胞诱导分化将有望在神经系统损伤和退行性病变疾病的治疗方面打开更广阔的应用前景。

[1]Miki T,Lehmann T,Hongbo C,et al.Stem Cell Characteristics of Amniotic Epithelial Cells[J].Stem Cells,2005,23(10）:1549.

[2]Ilancheran S,Michalska A,Peh G,et al.Stem Cells Derived from Human Fetal Membranes Display MultiLineage Differentiation Potential[J].Biol Reprod,2007,77(3）:577.

[3]Enosawa S,Sakuragawa N,Suzuki S.Possible use of amniotic cells for regenerative medicine[J].Nippon Rinsho,2003,61(3）:396.

[4]Tamagawa T,Oi S,Ishiwata I,et al.Differentiation of mesenchymal cells derived from human amniotic membranes into hepatocyte-like cells in vitro[J].Hum Cell,2007,20(3）:77.

[5]Takashima S,Ise H,Zhao P,et al.Human amniotic epithelial cells possess hepatocyte-like characteristics and functions[J].Cell Struct Funct 2004,29(3）:73.

[6]张 路,方 宁,陈代雄,等.人羊膜细胞有向心肌样细胞分化的特性[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(3）:401.

[7]Hayrick L.Theestablishment of a line(WISH）of human amnion cells in continuous cultivation[J].Exp Cell Res,1961,23:14.

[8]蔡 哲,舒 峻,潘 琳,等.人羊膜组织细胞的神经干细胞特性形态学研究[J].中国康复医学杂志,2008,23(12）:1077.

[9]Munoz-Elias G,Woodbury D.Black IB.Marrow stromal cells,mitosis,and neuronal diiferentiation:stem cell and precursor functions[J].Stem Cells 2003,21(4）:437.

[10]Susan K F,Naima M M.Culture of adipose tissue and isolated adipocytes methods mol boil[J].Humana Press Inc,2001,155:197.