杜 静,杜 玲,宴耀明,周 薇,陆 红,邹德学

(1.北京大学深圳医院,广东深圳 518036;2.襄樊市中医院,湖北襄樊 441000）

随着人们生活质量的提高,肥胖症与高脂血症的发病率日趋上升,已危害到人们的身体健康和生活质量,其防治成为当今亟待解决的问题。肥胖和高脂血症的主要原因是能量代谢失衡。有研究表明SIK2是一种重要的脂肪组织特异性的能量调控蛋白,在脂肪细胞的能量代谢中发挥着重要的调节作用[1]。RNA干扰技术(RNA interfering,RNAi）是近年来迅速发展起来的生物技术,已成为基因功能研究以及基因治疗的强有力工具[2]。实验以短发夹(Short hair RNA,shRNA）腺病毒为介导,构建靶向干扰脂肪细胞SIK2基因的表达载体,为进一步研究SIK2的功能提供技术手段,对于了解SIK2在脂代谢中的作用和调控机制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料3T3-L1细胞系购自ATCC公司。Lipofectamine 2000 脂质体和 Trizol、Adenoviral RNAi表达系统试剂盒购自Invitrogen公司。腺病毒纯化试剂盒购自Cell Biolabs公司。二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体、SIK2兔抗鼠抗体、化学发光试剂均购自Santa Cruz公司。胰蛋白酶购自Gibco公司。M-MLV逆转录酶(molony murine leukemia virus reverse transcriptase）购自 Promega公司,聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF）膜购自Amersham公司,DMEM和胎牛血清购自Gibco公司。SIK2和三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase,GAPDH）PCR引物由北京奥科生物技术有限公司合成,其余试剂均购自上海生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 重组腺病毒的设计 单链oligo、引物和探针设计:参照已发表的SIK2序列(NM-015191）设计互补ss oligos和引物,见表1。

表1 单链oligo引物设计

Oligo正义链中cgaa序列和反义链中ttcg序列为短发夹RNA的茎环结构,底划线部分序列为和穿梭质粒连接时的接头设计。以上序列由Invitrogen公司合成。……