赵冰冰 张 玮 李 力 阳志军

2002年，Shin等［1］应用酵母双杂交系统和谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase，GST)融合蛋白技术发现了一种C2H2型锌指蛋白，该蛋白可以与肿瘤坏死因子相关因子-6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6，TRAF-6)结合并对TRAF-6起抑制作用，因此将此锌指蛋白命名为TIZ(TRAF-6 inhibitory znic finger protein)。本课题组前期研究发现TIZ蛋白在卵巢癌血清中表达率较卵巢良性患者和正常卵巢患者高，有可能作为卵巢癌诊断的标志物［2］，但对于TIZ基因与卵巢癌的关系知之甚少。因此，本实验采用RT-PCR方法检测不同卵巢癌细胞株TIZ基因mRNA的表达水平，设计并筛选干扰效率较高的siRNA干扰片段构建RNAi载体，为进一步研究TIZ基因对卵巢癌细胞生物学功能的影响打下了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

卵巢上皮癌铂类敏感细胞系A2780、SKOV3和卵巢上皮癌铂类耐药细胞系A2780/DDP、A2780/CBP、SKOV3/DDP和 SKOV3/CBP(均为本试验室保存)［2］。Taq 酶购自 TAKARA 公司，Syber Green I购自上海捷瑞公司，质粒提取试剂盒购自三博远志公司。pTG19-T载体克隆载体购自上海捷瑞公司，pGPU6/GFP/Neo干扰载体购自吉玛公司，LipofectamineTM2000购自 Invitrogen公司，Biospin Gel Extraction Kit胶回收试剂盒由Bioflux公司提供，DH-5α菌株为本试验室保存。

1.2 实验方法

1.2.1 不同卵巢癌细胞系中TIZ基因表达的测定采用RT-PCR方法。引物设计:根据人类TIZ基因的mRNA序列设计RT-PCR引物，TIZ基因引物序列如下:TIZ基因上游引物:5'-CTGCCACATTCTTTACATTTG-3，下游引物:5'-GTTGCACAAGGGAGGTTAT-3，引物扩增片段为213bp。内参基因β-actin上游引物:5'-GATGACCCAGATCATGTTTG-3，下游引物 antisense:5'-TGGAGTTGAAGGTAGTTTCG-3，引物扩增片段为491bp，引物均由上海生物公司合成。细胞RNA提取采用Trizol一步法提取卵巢组织RNA，cDNA的合成采用RT逆转录试剂盒(TOYOBO公司提供，MMLV逆转录酶由Promega公司提供)，实验操作按说明书进行。PCR反应条件:预变性94℃ 5min，变性94℃ 30s，复性57℃ 30s、延伸72℃ 30s，进行 32 个循环后进一步延伸72℃ 10min。……