旭，孙立胜，史冬泉，

(南京大学医学院附属鼓楼医院，南京 210008)

生长分化因子5(GDF5)，又称软骨来源形成蛋白1，属骨形态发生蛋白(BMP)家族，也是转化生长因子 β(TGF-β)超家族成员之一［1］，是骨骼系统的主要调节因子，在骨骼发育过程中对软骨内成骨，骨与关节的形成起着重要作用［2］。2010年1～12月，我们采用PCR技术成功构建含GDF5基因表达载体pGL3-GDF5。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 载体pGL3-Basic，大肠杆菌DH10b感受态细胞(南京大学模式动物研究所高翔实验室馈赠)，高保真酶Primer Star，dNTP，T4连接酶，限制性内切酶BglⅡ、HindⅢ(大连宝生物工程有限公司)，基因组DNA抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒(Promega公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计及合成 根据GDF5的GenBank中NM000557检索序列，设计一对特异性引物(上海英骏生物技术有限公司合成)，5'端分别加入BglⅡ、HindⅢ酶切位点。上游引物序列:5'-GAAGATCTCT GGAAAGGATTCAAAACTAGGG-3'，下游引物序列:5'-CCCAAGCTTGGGGACAGATCCTGCTTT-3'。

1.2.2 基因组DNA提取 用基因组DNA抽提试剂盒提取健康人外周血基因组DNA，作为PCR扩增模板。

1.2.3 PCR 扩增 PCR 反应体系50 μl，反应参数:94℃预变性3 min后，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，于72℃延伸5 min。将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，按DNA凝胶回收试剂盒说明书纯化回收。

1.2.4 重组质粒pGL3-GDF5的构建 分别用限制性内切酶 BglⅡ和 HindⅢ对回收的 PCR产物和pGL3-Basic载体质粒进行双酶切，按照DNA凝胶回收试剂盒说明，切胶纯化酶切后的pGL3-Basic载体质粒大片段和GDF5基因启动子片段，在T4连接酶的作用下，将两者16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌DH10b感受态细胞，菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板，37℃培养箱中培养12 h，随机挑取2个阳性克隆，置于LB/Amp液态培养基中震荡培养12 h，根据质粒提取试剂盒说明书，提取质粒DNA(pGL3-GDF5)，BglⅡ和HindⅢ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，同时菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。……