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脑胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，表皮生长因子受体(EGFR)信号传导通路参与调节大多数肿瘤的发生、发展过程。EGF是EGFR的配体，EGF对胶质瘤的影响机制并不十分清楚。2010年6～8月，我们观察不同浓度的EGF对人脑胶质瘤细胞U251增值能力的影响，探讨EGF在细胞信号传导通路中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂 胶质瘤细胞株U251为本校实验室冻存。EGF(Sigma公司)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中配制成1 000 ng/ml母液，分装后－86℃保存。实验前用新鲜DMEM(Gibco公司)培养液按比例稀释至终浓度，冰上避光操作。MTT(Sigma公司)，鼠抗人Ki-67单克隆抗体及免疫组化其他试剂(福州迈新生物有限公司)。

1.2 细胞培养及分组 U251用含10%小牛血清的DMEM高糖培养基，37℃、5%CO2孵箱培养，培养液加1%双抗(青霉素、链霉素)，0.25%胰酶消化传代。

取对数生长期的细胞用无血清培养基培养6 h，再用含10%小牛血清的DMEM 培养液调整细胞浓度为 1 ×104，接种于96 孔板上，每孔180 μl，设空白对照孔。分别加入10、50、100、200 ng/ml的EGF作用24 h(实验组)，以不加EGF的细胞为对照组。各设5个复孔，37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养。

1.3 观测指标及方法 ①U251形态:采用倒置显微镜观察。②细胞增殖力:采用MTT法检测U251细胞增殖力。酶标仪设570 nm为检测波长，测各孔的吸光度值(A值)。③U251中 Ki-67:取对数生长期细胞滴加在多聚赖氨酸处理的无菌载玻片上，细胞爬满载玻片后经冷丙酮固定15 min，采用免疫组织化SP法检测细胞中Ki-67。以细胞核呈棕黄或棕褐色为阳性细胞，在高倍镜(400×)下随机选取10个视野，以阳性染色的细胞数与所测细胞数的比为增殖指数(PI)［1］。……