春，黎铁伟继全

(辽宁医学院，辽宁锦州121001)

人参皂苷Rh2(GS-Rh2)是从人参中提取的一种天然活性成分。国外研究表明［1］，GS-Rh2的抗肿瘤作用较为广泛，在肿瘤的预防和治疗方面具有较强的活性，具有抑制肿瘤的生长和诱导癌细胞凋亡的作用。目前国内研究相对较少。2010年6～11月，为了探讨GS-Rh2对肿瘤细胞的可能作用机制，我们以人脑胶质瘤细胞株U251为实验材料，观察GS-Rh2对U251凋亡的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 U251(购于中科院上海细胞库)，GS-Rh2(购于吉林宏久生物科技有限公司)，DMEM 培养基，胎牛血清，MTT、DMSO、DNA Marker DL2000、Taq DNA聚合酶、流式双染试剂盒、RTPCR试剂盒(大连宝生物公司产品)，Trizol、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体、Bcl-2鼠单抗(美国GBICO公司)。酶联免疫检测仪、流式细胞仪、多功能电泳仪，PCR仪，Biorad凝胶成像系统。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 按常规方法在培养瓶中培养U251，用含10% 胎牛血清的DMEM完全培养液置于37℃，5%CO2培养箱培养。取对数生长期细胞检测。

1.2.2 细胞增殖抑制率测算 采用MTT法。取对数生长期U251接种于96孔培养板(1×104/孔)，加入配制好的GS-Rh2(加药组)，使其终浓度分别为5、10、20、40、80 μg/ml(以不加 GS-Rh2 者为对照组)，每孔设4个复孔，用新鲜培养基补充至每孔100 μl，37 ℃、5%CO2孵箱中培养 48 h 后，改用不加胎牛血清的培养基继续培养4 h，加入MTT液(5 mg/ml)20 μl。检测波长为570 nm处的吸光值(A值)。细胞抑制率=(1－加药组A值/对照组A值)×100%。通过细胞增殖抑制曲线求出抑制率(IC)为 IC30、IC50、IC70值时的 GS-Rh2 浓度。

1.2.3 细胞凋亡率检测 收集 IC30、IC50、IC70的GS-Rh2作用48 h后的U251，采用Annexin V-FITC/PI双标记检测，用流式细胞术观察细胞凋亡情况。

1.2.4 U251 中 Bcl-2、Caspase-3 mRNA 及蛋白检测①U251中Bcl-2、Caspase-3 mRNA检测:采用RTPCR技术。分别收集对照组和加药组(IC50)处理12、24、48、72 h 的细胞，按 Trizol试剂盒说明书分别提取细胞中总RNA，逆转录制备 cDNA，产物进行PCR。……