春，黎铁伟继全

(辽宁医学院，辽宁锦州121001)

人参皂苷Rh2(GS-Rh2)是从人参中提取的一种天然活性成分。国外研究表明［1］，GS-Rh2的抗肿瘤作用较为广泛，在肿瘤的预防和治疗方面具有较强的活性，具有抑制肿瘤的生长和诱导癌细胞凋亡的作用。目前国内研究相对较少。2010年6～11月，为了探讨GS-Rh2对肿瘤细胞的可能作用机制，我们以人脑胶质瘤细胞株U251为实验材料，观察GS-Rh2对U251凋亡的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 U251(购于中科院上海细胞库)，GS-Rh2(购于吉林宏久生物科技有限公司)，DMEM 培养基，胎牛血清，MTT、DMSO、DNA Marker DL2000、Taq DNA聚合酶、流式双染试剂盒、RTPCR试剂盒(大连宝生物公司产品)，Trizol、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体、Bcl-2鼠单抗(美国GBICO公司)。酶联免疫检测仪、流式细胞仪、多功能电泳仪，PCR仪，Biorad凝胶成像系统。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 按常规方法在培养瓶中培养U251，用含10% 胎牛血清的DMEM完全培养液置于37℃，5%CO2培养箱培养。取对数生长期细胞检测。

1.2.2 细胞增殖抑制率测算 采用MTT法。取对数生长期U251接种于96孔培养板(1×104/孔)，加入配制好的GS-Rh2(加药组)，使其终浓度分别为5、10、20、40、80 μg/ml(以不加 GS-Rh2 者为对照组)，每孔设4个复孔，用新鲜培养基补充至每孔100 μl，37 ℃、5%CO2孵箱中培养 48 h 后，改用不加胎牛血清的培养基继续培养4 h，加入MTT液(5 mg/ml)20 μl。检测波长为570 nm处的吸光值(A值)。细胞抑制率=(1－加药组A值/对照组A值)×100%。通过细胞增殖抑制曲线求出抑制率(IC)为 IC30、IC50、IC70值时的 GS-Rh2 浓度。

1.2.3 细胞凋亡率检测 收集 IC30、IC50、IC70的GS-Rh2作用48 h后的U251，采用Annexin V-FITC/PI双标记检测，用流式细胞术观察细胞凋亡情况。

1.2.4 U251 中 Bcl-2、Caspase-3 mRNA 及蛋白检测①U251中Bcl-2、Caspase-3 mRNA检测:采用RTPCR技术。分别收集对照组和加药组(IC50)处理12、24、48、72 h 的细胞，按 Trizol试剂盒说明书分别提取细胞中总RNA，逆转录制备 cDNA，产物进行PCR。Bcl-2 引物序列:上游:5＇-AAC TCG AGT GAC AAG CCC GTA G-3 ＇，下 游:5 ＇-GTA CCA CCA GTT GGT TGT CTT TGA-3＇，预期扩增片段长度133 bp;Caspase-3引物序列:上游:5＇-AGA CTG ACT GGA AAG CCG AA-3＇，下游:5＇-CGG GAT CTG TTT CTT TGC AC-3＇，预期扩增片段长度342 bp;β-actin 引物序列:上游:5＇-GGC ATG GGT CAG AAG GAT TCC-3＇;下游 5＇-ATG TCA CGC ACG ATT TCC CGC-3＇，预期扩增片段长度500 bp。反应条件:94℃ 5 min后进入下列循环:94 ℃ 30 s、62 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，共39个循环，72℃延伸7 min后终产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳，成像拍照，用Gene Tools图像分析软件分析。各组细胞中Bcl-2、Caspase-3与β-actin基因条带灰度比为其mRNA半定量表达水平。②U251中Bcl-2、Caspase-3蛋白检测:采用Western blot法。将对数生长期细胞换液加入IC50的GS-Rh2，分别作用 0、12、24、48、72 h，裂解细胞，提取细胞总蛋白，电泳分离。以β-actin为内对照。Bcl-2/β-actin、Caspase-3/β-actin分别为 Bcl-2、Caspase-3蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。数据用x¯±s表示，两样本均数比较采用独立样本配对t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GS-Rh2对U251增殖的影响 对照组细胞无生长抑制;给药组中给予 5、10、20、40、80 μg/ml的GS-Rh2作用后，U251生长抑制率分别为19.34%、33.09%、46.28%、58.37%、72.91%;两组比较，P ＜0.05，其细胞生长抑制呈剂量依赖关系(P均 ＜0.05)。根据细胞增殖抑制曲线求得 IC30、IC50、IC70的 GS-Rh2 作用浓度分别为 10.6、22.3、70.2 μg/ml。

2.2 两组细胞凋亡情况 对照组细胞凋亡率为3.85%，IC30、IC50、IC70的 GS-Rh2 作用 48 h 时 U251凋亡率分别为 20.37%、49.39%、70.82%，两组比较，P＜0.05。随药物浓度的增加，细胞凋亡率升高(P 均 ＜0.05)。

2.3 U251中 Bcl-2和Caspase-3 mRNA表达变化成功获得 Bcl-2 mRNA 133 bp、Caspase-3 mRNA 342 bp。两组细胞中Bcl-2和Caspase-3 mRNA表达水平见表1。

表1 两组不同时点细胞中Bcl-2、Caspase-3 mRNA相对表达量比较(±s)

表1 两组不同时点细胞中Bcl-2、Caspase-3 mRNA相对表达量比较(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别Bcl-2 mRNA Caspase-3 mRNA对照组0.968 1 ±0.005 1 0.322 9 ±0.001 7给药组12 h 0.890 7 ±0.004 1 0.401 8 ±0.001 5 24 h 0.763 2 ±0.004 3* 0.744 9 ±0.004 2*48 h 0.431 9 ±0.001 4* 0.884 1 ±0.004 4*72 h 0.357 8 ±0.001 8* 0.976 4 ±0.004 9*

2.4 U251中 Bcl-2、Caspase-3蛋白表达变化 随GS-Rh2作用时间的延长，U251中Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低、Caspase-3蛋白表达明显增高。见表2。

表2 两组不同时点细胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白相对表达量比较(±s)

表2 两组不同时点细胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白相对表达量比较(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别 Bcl-2蛋白 Caspase-3蛋白对照组0.82 ±0.02 0.27 ±0.06给药组12 h 0.72 ±0.02 0.39 ±0.01 24 h 0.62 ±0.02* 0.59 ±0.02*48 h 0.40 ±0.05* 0.69 ±0.02*72 h 0.29 ±0.02* 0.81 ±0.02*

3 讨论

目前手术切除是脑胶质瘤主要的治疗手段，但临床远期疗效不理想。大量研究表明，GS-Rh2在肿瘤的预防和治疗方面具有较强活性，Rh2对多种肿瘤细胞如小鼠黑色素瘤B16细胞、C6胶质瘤细胞、人肝癌细胞SK-HEP-1等具有增殖抑制和诱导凋亡作用［2］;Rh2可以从诱导细胞凋亡、诱导细胞分化、抑制肿瘤DNA合成、提高机体免疫功能等各方面发挥抗肿瘤作用［3］。GS-Rh2的抗肿瘤作用较为广泛，既可阻滞细胞周期，诱导癌细胞凋亡和抑制肿瘤的生长或诱导细胞分化使其逆转，抑制肿瘤的转移;又可调节机体免疫功能，增强机体对疾病的抵抗能力;还可增强抗癌药的药效。

细胞凋亡是一极其复杂的生物学过程，是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列瀑布式激活的主动性死亡过程，它受多种基因调控，其中Bcl-2是最为重要的抑制细胞凋亡的基因。Bcl-2高表达的细胞存活时间明显地延长［4］，其主要通过产生抗氧化剂或抑制氧自由基而抑制细胞凋亡［5］，是细胞凋亡的关键性调节因子［6］。

细胞凋亡过程还与 Caspase家族密切相关［7，8］。Caspase-3是目前发现的Caspase家族中引起细胞凋亡的关键性酶，也是参与细胞凋亡的主要成分。有研究结果表明［9，10］，通过抑制 Caspase-3 基因活性或拮抗其功能可使细胞凋亡受抑，细胞可无限增殖，因此Caspase-3对于调控细胞凋亡起重要作用。

本研究结果显示，GS-Rh2对U251有增殖抑制作用，且随着GS-Rh2药物浓度的增加，细胞受抑制程度明显增强。根据细胞增殖抑制曲线求得IC30、IC50、IC70的 GS-Rh2 作用浓度分别为 10.6、22.3、70.2 μg/ml。在 IC50的 GS-Rh2 作用 48 h 后，U251呈明显的抑制增殖。流式细胞术检测细胞凋亡率证实，IC30、IC50、IC70的 GS-Rh2 作用48 h 时 U251 凋亡率分别为 20.37%、49.39%、70.82%，且随药物浓度的增加，细胞凋亡率升高(P＜0.05)。证实GSRh2可抑制人脑胶质瘤细胞株U25l的增殖，可以导致细胞凋亡率的增加，表明GS-Rh2在胶质瘤治疗中将具有一定的疗效。

我们通过RT-PCR及Western blot技术检测发现，U251经IC50的GS-Rh2处理后，自处理后的24 h开始 Bcl-2 mRNA、蛋白表达水平逐渐降低，Caspase-3 mRNA、蛋白表达水平逐渐增高，表明GSRh2诱导U251凋亡作用与下调细胞中Bcl-2表达、上调Caspase-3表达有关。

通过研究我们认为，Gs-Rh2是一种天然的抗肿瘤药物，对于临床肿瘤的治疗可发挥重要作用。

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