张 娜，周 卫，王文溪，尹秀菊，滕利荣，林 凤

(吉林大学 生命科学学院，吉林 长春 130012)

白囊耙齿菌(Irpex lacteus.Fr)是多孔菌科木材腐生真菌［1］，主要分布于长白山林区和黑龙江、河北、山西、甘肃、江西、福建、云南、西藏等地［2］。多将其液体发酵产物作为研究对象，临床上主要用于慢性肾小球肾炎的治疗［3］。目前，对白囊耙齿菌中有效成分的研究主要集中在多糖［4］及糖蛋白［3］。腺苷(Adenosine)是核苷的一种，在生物化学上扮演着重要角色。腺苷在炎症反应中具有重要作用，对中性粒细胞、巨噬细胞的功能具有抑制作用［5-6］。在临床上，腺苷多用于心肌保护和心脏功能的修复［7-9］。

响应面分析法(Response surface analysis methodology，RSM)能将多因子实验中各个因子与响应值之间的复杂关系，以多元二次回归方程表示，简单、快速地对实验进行全面的研究，并得到最优化参数［10-11］。

在一些标题的翻译中，译者还别出心裁地从目的语出发，重新创造标题，这些标题常常是原文中心思想的高度概括或是原文主要内容的别样显示。这样的例子很多，比如：

本文采用RSM对白囊耙齿菌中腺苷提取工艺进行了研究，通过实验数据拟合模型，研究提取温度、提取时间和液料比对腺苷得率的影响以及各因素之间的相互作用，确定最优的提取工艺，为白囊耙齿菌的进一步开发利用奠定了一定理论基础。

1 材料

白囊耙齿菌(吉林省通化市林海药业提供);白囊耙齿菌菌丝体(由本实验室液体发酵获得);腺苷对照品(Sigma公司，纯度99%);乙腈和甲醇均为色谱纯;其他试剂均为国产分析纯。

他们常常运用一些绝妙而惊人的点子，对照片进行巧妙加工，接受后现代主义发起的挑战。与辛蒂·舍曼(Cindy Sherman)和大卫·拉切贝尔(David LaChapelle)一样，桑迪·斯各格兰德是“装置摄影”艺术的杰出探索者之一。

白囊耙齿菌菌丝体干粉1 g，加水浸提。10 000 r/min 离心10 min，分离上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，滤液用于腺苷含量测定。

2 方法

2.1 样品预处理

采用高效液相色谱法测定样品中腺苷的含量［12］。流动相为磷酸盐缓冲液(pH 6.5)-甲醇(85∶15)。色谱柱为C18柱，流速1 mL/min，检测波长260 nm，柱温35℃，进样量20 μL。按外标法，以峰面积计算腺苷含量。腺苷得率=(提前得到的腺苷质量/菌丝体干粉质量)×100%。

2.2 菌丝体中腺苷的提取方法

Eppendorf 5810R型高速冷冻离心机(德国);岛津LC-10TA高效液相色谱仪(日本)。

2.3 腺苷得率的测定方法

采用液体深层发酵的方法获得白囊耙齿菌发酵液，经抽滤得到菌丝体，并用水洗涤2次。菌丝体真空冷冻干燥，用多功能粉碎机粉碎后过60目筛，制成白囊耙齿菌菌丝体干粉备用。

2.4 单因素试验优化腺苷提取条件

3.1.3 液料比对腺苷得率的影响 白囊耙齿菌菌丝体干粉分别按液料比 5∶1，10∶1，20∶1，25∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，提取温度 40 ℃，提取 2.5 h。然后取上清液测定腺苷得率，结果如图3所示。从图3可看出，腺苷得率随液料比的增大呈逐渐上升趋势，液料比到达40∶1时，腺苷得率已趋于稳定，从节约资源方面考虑，选取液料比40∶1为最适值进行下一步优化。

采用SAS RSREG程序对表2中数据进行响应面分析，多元二次回归方程为:

2.5 响应面法优化腺苷提取条件

纵观现阶段我国市场经济的发展过程中，众多企业纷纷关注到了财务管理的重要，纷纷从公司的治理结构来透视企业财务管理情况。财务管理作为企业日常管理的重要组成部分，对于企业的治理结构的优化以及未来的发展都至关重要。当前随着企业走上市的创新途径，在复杂竞争环境中的发展压力也越来越大。要想排除企业的一切风险要素，提升企业的市场竞争力，还需要积极从公司的治理结构和财务管理角度进行深入分析。进一步明确新时期现代财务管理的目标。以此为企业的改革和发展提供积极导向作用。

在单因素试验的基础上，进行三因素三水平的Box-Benhnken的中心组合试验设计，见表1。采用响应面分析法研究三个随机因子(提取温度、提取时间和液料比)对响应值(腺苷得率)的影响。用SAS V8.0的实验设计工具箱对试验结果进行回归拟合，对回归方程和关键因素进行方差分析，并得到最优的腺苷提取条件。应用matlab 7.0根据响应方程绘制响应曲面图和等高线图直观分析图。

表1 中心组合设计的因素与水平表Tab.1 Factors and levels of RSM analysis

3 结果与讨论

3.1 单因素试验优化腺苷提取条件

3.1.1 提取温度对腺苷得率的影响 白囊耙齿菌菌丝体干粉按液料比20∶1，提取温度分别为30，40，50，60，70 ℃，提取 3.5 h。然后取上清液测定腺苷得率，结果如图1所示。从图1中可以看出，温度为40℃时腺苷得率最高。提取温度低于40℃时腺苷得率随温度的升高而增加，高于40℃时腺苷得率反而下降，这是由于在一定范围内升高温度，有助于腺苷从细胞中溢出，但当温度过高时，腺苷的分解效应会逐渐取代腺苷的溢出效应，故腺苷得率反而下降。

李景星在《史记评议》中对此大加赞赏，他说“天地日月，难以形容；圣如孔子，亦难以形容。孟子称为圣之时，已是创论。而史公世家，更称之为至，尤为定评。自是之后，遂永远不能易矣。”[2](P141)可见，司马迁对孔子推崇备至。司马迁把孔子放到“至圣”的崇高地位，反映了他评价历史人物的独到眼光，也反映了他对孔子的深刻认同。司马迁首先称孔子为“至圣”，把孔子的地位大大提高了，在《史记》中司马迁又是怎样表现他对“至圣”孔子的关注呢？

图1 提取温度对腺苷得率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of adenosine

3.1.2 提取时间对腺苷得率的影响 白囊耙齿菌菌丝体干粉按液料比20∶1，提取温度40℃，分别提取 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h。然后取上清液测定腺苷得率，结果如图2所示。从图2可以看出，提取时间为2.5 h时腺苷得率最大，在2.5 h前，随提取时间的延长呈逐渐上升趋势;提取时间到达2.5 h后，腺苷得率反而有下降趋势。这是由于在一定范围内，延长提取时间，腺苷可以更充分的从菌丝体中溶出，当提取时间继续增加时，腺苷的分解将降低腺苷得率。

图2 提取时间对腺苷得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the yield of adenosine

按照2.2项下方法提取白囊耙齿菌中的腺苷，采用单因素试验分别考察提取温度、提取时间、液料比对腺苷得率的影响。

图3 液料比对腺苷得率的影响Fig.3 Effect of solvent/solid on the yield of adenosine

3.2 响应面法优化腺苷提取工艺

根据单因素试验得到的优化结果，以X1=(Z1－40)/10，X2=(Z2－2.5)/1，X3=(Z3－20)/20 为自变量，以腺苷得率Y为响应值，进行三因素三水平的Box-Behnken中心组合实验设计，因素和水平的设计见表1，实验设计方案及结果如表2所示，采用多元二次回归方法对试验结果进行响应分析，并采用偏导方法求解多元二次回归方程的极值，得到最佳的腺苷提取条件。

表2 Box-Behnken中心组合设计方案及试验结果Tab.2 Box-Behnken experiments design and the results of experiments

大学生心理亚健康问题初探…………………………………………………………………………………………李汝湘（1.53）

回归模型的相关系数R2为0.998 7，调整R2为0.996 4，说明回归方程高度显著，模型的拟合度很好，响应值的99.64%来自于所选变量。由表3的分析结果可以看出，模型回归P为0.000 1，说明模型回归显著可靠，使用该方程代替真实的实验点进行分析是可行的，能够对响应值(腺苷得率)进行预测。

由表3可以看出，一次项p(0.000 1)为高度显著项，说明所选因素与响应值之间存在显著的线性关系;同时，平方项p(0.000 1)为高度显著项，说明所选因素对响应值的影响是高度卷曲的，由图4可以直观的看出响应曲面的高度卷曲。所考察因素中X2，X3，X1X1，X3X3均为影响高度显著项，X1X2为影响显著项，说明实验因素与响应值之间不只是简单的线性关系，二次项和交互项对响应值的影响很大，并且方程的拟合是充分的。因此，可以利用该回归方程确定白囊耙齿菌中腺苷的最佳提取工艺。

图4是根据响应方程所绘制的响应曲面和等高线图，它们能直观地描述两个因素之间的交互作用对响应值的影响。由图4A可看出，其等高线呈椭圆形，椭圆形的轴线与X1和X2坐标轴存在一个角度，说明X1(提取温度)和X2(提取时间)存在明显的交互作用。X1X2项(提取温度与提取时间间的交互项)的P(0.019 4)为影响显著项。当X2处于一定值时，X1对腺苷得率随的影响呈抛物线变化;当X1处于低水平时，即提取温度较低时，增加提取时间能明显提高腺苷的得率，而当X1处于高水平时，即提取温度较高时，增加提取时间腺苷得率反而降低，表明X1和X2间有高度显著的交互作用。X1的最适值为正值，而X2的最适值为负值，这两个因素互相抑制，与回归方程中X1X2项系数为负号相符。图4B显示X3(液料比)对响应值的影响曲线比较陡峭，同时X3由低水平变化到高水平过程中等高线的数目明显多于X1(提取温度)，说明液料比对腺苷得率的影响高度显著。图4B中等高线呈椭圆形，但是椭圆轴线与X1坐标几乎平行，说明X1和X3之间的交互作用不显著。这两个因素的最适值均为正，存在互相促进作用，这与回归方程中X1X3项系数为正号相符。从图4C中也可得出相似的结论，液料比对腺苷得率的影响高度显著(p为0.000 1);而X2和X3之间的交互作用不显著;X2和X3之间存在相互促进的作用。

采用SAS工具箱计算腺苷超声波法最优提取条件的编码值为:X1= － 0.057，X2=0.922，X3=0.522。根据编码值与非编码值的转换式解得Z1=39.4 ℃、Z2=3.4 h 和 Z3=50.4∶1。因此，白囊耙齿菌中腺苷的最佳提取工艺为提取温度39.4℃，提取时间3.4 h，料水比50.4∶1。由回归方程预测腺苷得率的理论值可达到1.11%。

由于点A满足两个条件，即∠CAD=45°，AB=3，满足双轨迹的基本条件，由∠CAD=45°，C与D是两个定点，即点A是定角轨迹；由AB=3，点A到CD的距离为3，点A就是定向轨迹，构造两个轨迹，其交点就是点A；作AB⊥CD，垂足为B.

表3 回归分析结果Tab.3 Statistical results of regression analysis

图4 响应面图和等高线图Fig.4 Responsive surfaces and contours

3.3 验证试验

采用模型预测的最佳提取条件进行腺苷提取的验证试验，三次平行试验得到腺苷得率的平均值为1.09%，与理论预测值(1.11%)的相对误差为1.80%，可见预测值与试验值吻合很好，具有实际应用价值。

4 结论

在本工艺中，提取时间和液料比的一次项和平方项对腺苷得率的影响高度显著，提取温度和提取时间的交互项对腺苷得率影响显著。最优提取工艺为:提取温度 39.4 ℃，提取时间 3.4 h，料水比50.4∶1，3 次验证试验腺苷平均得率为 1.09%。采用响应面分析法优化白囊耙齿菌腺苷的水提工艺，准确可靠，具有实际应用价值。同时，为白囊耙齿菌的研究开发奠定了一定理论基础。但研究发现腺苷提取液中还含有大量的多糖、蛋白质、甘露醇等其他物质，对于腺苷提取液的进一步开发利用尚需要深

入研究。

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