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HPLC测定草乌与贝母配伍后乌头碱类成分含量的变化

2011-07-21宋俊英赵平鸽余陈欢吴巧凤

中国生化药物杂志 2011年5期
关键词:草乌甲酰浙贝母

宋俊英,赵平鸽,余陈欢,吴巧凤

(1.浙江义乌市中心医院,浙江 义乌 322000;2.浙江中医药大学 药学院,浙江 杭州 310053)

草乌为毛茛科植物北乌头(Aconitum kusnezoffii Reichb.)的干燥块根,具有祛风除湿、温经止痛的功能,用于风寒湿痹、心腹冷痛等症[1],其主要成分为生物碱,其中乌头碱为其有效成分及主要毒性成分[2-3]。浙贝母为百合科贝母属植物浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)的干燥鳞茎,为“浙八味”之一,为江浙地区的道地药材,具清热润肺,化痰止咳及散结等功效,主要含有贝母甲素、贝母乙素等生物碱成分[4-5]。生草乌与浙贝母均为临床常用中药,但两者有配伍禁忌,传统中医理论中有“半蒌贝蔹芨攻乌”之说,认为乌头类中药(包括附子、乌头、草乌)与贝母(浙贝母、川贝母)互为“相反”药物,两者药物经配伍应用可增强药物的毒副作用,历代医药学家遵信者居多,并以此为戒,不敢越雷池半步。

但近几年来,不断有学者报道,在临床实践中,发现这两种药物经配伍使用后并未发现明显的毒副作用,且有相反相成的作用。李远实[6]报道,生草乌与浙贝母焙干研末醋调制成饼外用贴于内关、期门二穴,可产生局部刺激作用,对顽呃有奇效;王为民[7]采用高效液相色谱(HPLC)法对乌头反贝母进行了化学配伍规律研究,结果表明乌头配伍贝母后毒性增加幅度不大。但目前有关生草乌与浙贝母配伍的化学与药理毒理研究未见报道。本实验采用HPLC法,测定生草乌与浙贝母不同配比水煎液及其经人工胃、肠液解离后的溶液中乌头碱及乌头碱水解产物焦乌头碱、苯甲酰乌头碱和苯甲酸含量的变化,阐明生草乌与浙贝母不同比例配伍后乌头碱类毒性成分的变化规律和毒性作用的物质基础。

1 材料

生草乌(产地:四川安县,批号:090319)、浙贝母(产地:浙江磐安,批号:080710),均购自浙江中医药大学中药饮片厂,经本校资源鉴定教研室俞冰副教授鉴定,分别为北乌头 Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥块根和浙贝母 Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鳞茎。

乌头碱对照品(供含量测定用,批号:110720-200410),中国药品生物制品检定所;乙腈(色谱纯,批号:20100412),上海凌峰化学试剂有限公司;其他所用试剂均为分析纯;

Waters 1525型高效液相色谱仪(配Waters 2998 PAD检测器、Empower色谱工作站),美国Waters公司;KQ-5200型超声波清洗器(40 kHz,200 W),昆山市超声仪器有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm,5 μm),流动相:乙腈-醋酸铵缓冲液(pH 10.5)(60∶40),流速:1.0 mL/min,检测波长:240 nm,柱温:28℃。理论板数按乌头碱、焦乌头碱、苯甲酰乌头碱和苯甲酸峰计均不低于3 000。结果见图1。

2.2 样品溶液的制备

2.2.1 草乌、贝母单煎液的制备 称取生草乌、贝母各10 g,分别加20倍量水煎煮,冷却后过滤,浓缩至10 mL,即得草乌及贝母单煎液。每1 mL煎液相当于生药1 g。

图1 乌头碱类成分及苯甲酸对照品(A)、草乌单煎液(B)的HPLC色谱图Fig.1 The HPLC chromatograms of Aconitine-type alkaloids and Benzoic acid(A),the extraction of A.Kusnezoffii(B)

2.2.2 草乌贝母不同配比合煎液的制备 分别称取生草乌5 g和贝母5 g、生草乌5 g和贝母10 g、生草乌10 g和贝母5 g,分别加20倍量水煎煮,冷却后过滤,浓缩至10 mL,即得草乌贝母3种配比(1∶1、1∶2、2∶1)的合煎液。

2.2.3 草乌、贝母单煎后混合液的制备 取2.2.1项下草乌和贝母单煎液,分别按生药量1∶1、1∶2和2∶1混合,即得草乌贝母 3 种配比(1∶1、1∶2、2∶1)的单煎后混合液。

2.2.4 草乌贝母合煎液的人工消化处理 分别取草乌贝母不同配比合煎液5 mL,加入人工胃液或人工肠液(按中国药典2005年版一部附录ⅫA制备)100 mL,模拟人体内消化环境,于37℃恒温水浴振荡处理1 h,4 000 r/min离心10 min,取上清液,浓缩至10 mL。

2.3 乌头碱及其水解产物的含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 参考《中国药典2010版》和文献报道[8],根据乌头碱水解的热力学和动力学原理,制备其不同的水解产物。

2.3.1.1 焦乌头碱的制备 取乌头碱对照品1.9 mg,滴入微量甲醇并超声使其溶解,加入水适量,用微孔滤膜将其滤过于5 mL量瓶中,加水至刻度,得水解前原溶液,50℃恒温箱中放置30 min,取出立即放置冰水浴中终止其水解反应,即得焦乌头碱对照品溶液。焦乌头碱浓度以原溶液中乌头碱的摩尔浓度进行折算。

2.3.1.2 苯甲酰乌头碱和苯甲酸的制备 取乌头碱0.95 mg,滴入微量甲醇并超声使溶,加水适量,用微孔滤膜滤过,置5 mL量瓶中,加水至刻度,制得水解前原液,置120℃烘箱处理后,得水解后溶液,即苯甲酰乌头碱和苯甲酸溶液。苯甲酰乌头碱和苯甲酸浓度以原溶液中乌头碱的摩尔浓度进行折算。

2.3.1.3 混合对照品溶液的制备 精密取乌头碱对照品溶液、焦乌头碱对照品溶液、苯甲酰乌头碱对照品溶液适量,并精密称取苯甲酸对照品适量,置同一5 mL量瓶中,加甲醇溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,得乌头碱、焦乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酸浓度分别为0.057,0.044,0.044 和0.032 mg/mL 的混合对照品溶液,备用。

2.3.2 线性关系的考察 精密吸取混合对照品溶液 2.5,5,10,15,20 μL,分别注入液相色谱仪,以峰面积(Y)为纵坐标,含量(X,μg)为横坐标,绘制标准曲线,求得回归方程分别为:乌头碱:Y=790 995 X+2 804,r=0.999 9;焦乌头碱:Y=444 064 X+168,r=0.999 7;苯甲酰乌头碱:Y=503 012 X+11 080,r=0.999 6;苯甲酸:Y=101 941 X+1 540,线性范围依次为 0.14 ~1.14,0.12 ~0.92,0.11 ~0.89,0.079 ~0.63 μg。

2.3.3 精密度试验 取混合对照品溶液分别进样5次,每次10 μL,结果乌头碱、焦乌头碱、苯甲酰乌头碱和苯甲酸峰面积的 RSD值分别为0.51%,2.89%,2.31%和 0.82%,表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取草乌贝母(1∶1)合煎供试品溶液,分别在 0,2,4,8,12 和 24 h 进行测定,记录峰面积,结果乌头碱、焦乌头碱、苯甲酰乌头碱和苯甲酸峰面积的 RSD 分别为 2.27%,2.84%,2.12%和1.66%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取草乌贝母(1∶1)合煎液,平行制备供试品溶液5份,测定峰面积,结果乌头碱、焦乌头碱、苯甲酰乌头碱和苯甲酸峰面积的RSD分别为 2.11%,3.24%,1.16%和 0.97%,表明重复性良好。

2.3.6 回收率试验 平行吸取已知乌头碱类成分含量的草乌贝母(1∶1)合煎液5份,加入等量的对照品混合溶液,平行制备供试品溶液,测定峰面积,按外标法计算含量,并求回收率。结果乌头碱、焦乌头碱、苯甲酰乌头碱和苯甲酸的平均回收率分别为99.7%,100.9%,99.5% 和 97.6%,RSD(n=5)分别为 2.11%,3.24%,1.16%和 0.97%。

2.4 样品含量测定

分别取2.2项下制备的溶液,适当稀释,按2.1项下色谱条件测定,计算含量,其中,总生物碱含量为样品中乌头碱、焦乌头碱和苯甲酰乌头碱含量之和。由于各配伍液中草乌所占比例各不相同,为便于横向比较草乌贝母不同配伍比例条件下贝母对草乌中乌头碱及其水解产物含量的影响,故本实验结果按草乌的投药量进行折算,以统一不同配比对草乌中乌头碱类成分含量变化的影响。结果见表1。

表1 草乌贝母配伍后各乌头碱及其水解成分含量的变化Tab.1 The contents of aconitine and its hydrolysate in extractions prepared with A.Kusnezoffii and F.thunbergii in different ratios

3 讨论

乌头类药材中主要含有乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等双酯型二萜类生物碱。这些成分既是药效成分,也是毒性成分,在一定条件下可部分水解为单酯型生物碱,毒性大为降低,继续水解则进一步变为胺醇类生物碱,毒性更小[9]。本研究采用HPLC法测定了草乌中双酯型乌头类生物碱乌头碱及其两种水解产物的含量,克服了以往研究对该类药物仅测定含量只占极少数的原型(双酯型)生物碱的弊端,为含有草乌、附子等以及乌头类生物碱为主要药效成分的一大类中药制剂提供了更加科学的质量评价依据。但在本实验中仅检测到乌头碱及其水解产物,未检测到新乌头碱、次乌头碱等双酯型二萜类生物碱,这可能与实验所选药材品种有关。

本实验采用HPLC法,以乌头碱、焦乌头碱、苯甲酰乌头碱及苯甲酸为含量测定对象,比较草乌与贝母不同配比在煎煮过程及体外模拟消化环境中乌头碱类成分的含量变化。由表1可知,除草乌贝母(2∶1)合煎液外,草乌贝母不同配比合煎或单煎后混合液中乌头碱的含量较草乌单煎液明显提高,其中以草乌贝母单煎混合后的溶液中乌头碱及其水解产物的含量最高。可见,草乌贝母配伍后可增加合煎或单煎后混合液中乌头碱类生物碱的含量,证实了“草乌反贝母”的科学性。

据报道[10],乌头碱在高温或酸性条件下可水解生成苯甲酰乌头碱和苯甲酸。由于苯甲酸具有一定的挥发性,因此在草乌单煎液中仅检出少量苯甲酸,而在草乌贝母合煎液中未检出;然而草乌贝母单煎后的混合液中却含有大量的苯甲酸,其含量高于草乌单煎液,但乌头碱的含量却不减反增,这进一步证实了“草乌反贝母”的科学性。

实验中还发现,草乌贝母不同配比中,无论是乌头碱及其水解产物,还是总生物碱,均以草乌贝母1∶1配伍后含量最高。经人工胃、肠液处理后,各样品溶液中乌头碱、焦乌头碱及苯甲酰乌头碱的含量显著降低,但同时也发现,各样品溶液中乌头碱、焦乌头碱及苯甲酰乌头碱的构成比也明显变化,草乌贝母1∶1合煎液中三者的构成比为1∶9∶21,而经人工胃液处理后为1∶128∶63,人工肠液处理后为1∶15∶44,证明人工胃、肠液(特别是人工肠液)一方面可降低溶液中乌头碱类成分的含量,同时也可促进乌头碱的解离从而影响草乌发挥毒性作用的物质基础。但即使是总生物碱含量最高的草乌贝母(1∶1)合煎经胃液处理后,按生草乌临床剂量3 g折算,其乌头类成分小鼠口服给药量为0.26 mg/kg,远低于研究报道的1.8 mg/kg半数致死量[11]。因此,“草乌反贝母”是在一定条件下的配伍禁忌,还与其给药量和给药途径有关。

中药成分复杂,配伍出现相反,有可能是有新的有毒物质产生或有毒物质含量增高,或者是活性成分药效抵消等情况[9-10]。本实验结果可为草乌与贝母的配伍应用提供可靠依据,从有毒化学成分含量变化的角度证实了“草乌反贝母”的科学性。

[1]李梦然,曲 玮,梁敬钰.乌头属化学成分和药理作用研究进展[J].海峡药学,2010,22(4):1-6.

[2]Csupor D,Forgo P,Wenzig E M,et al.Bisnorditerpene,norditerpene,and lipo-alkaloids from Aconitum toxicum[J].J Natu Prod,2008,71(10):1779-1782.

[3]Liu M,Zhang H,Zhao L,et al.LC separation and determination of five diester-diterpenoid alkaloids in the unprocessed and processed aconite roots[J].Chromatographia,2008,67(11):1003-1006.

[4]阮汉利,张勇慧,潘旭初,等.杂交贝母生物碱成分的研究[J].中国中药杂志,2004,29(4):331-334.

[5]童志远,颜晓燕.贝母化学成分及质量控制方法研究进展[J].西南军医,2009,11(2):260-261.

[6]李远实.生草乌、浙贝母合用贴穴止顽呃案[J].陕西中医,1996,17(8):373-374.

[7]王为民.对乌头反贝母、瓜蒌、半夏的探讨[J].时珍国医国药,2004,15(3):183-184.

[8]孙婷婷,栾立标.HPLC分离测定四逆汤中3种双酯型生物碱及其6种水解产物[J].中国中药杂志,2006,31(19):1634-1638.

[9]翁小刚,聂淑琴,黄璐琦.HPLC测“半蒌贝蔹芨攻乌”中乌头与其它诸药合煎前后次乌头碱的含量变化[J].中国药学杂志,2004,39(1):57-59.

[10]Chen J H,Lee C Y,Liau B C,et al.Determination of aconitinetype alkaloids as markers in fuzi(Aconitum carmichaeli)by LC/(+)ESI/MS3[J].J Pharm Biomed Ana,2008,48:1105-1111.

[11]Singhuber J,Zhu M,Prinz S,et al.Aconitum in traditional chinese medicine—a valuable drug or an unpredictable risk[J].J Ethnopharmacol,2009,126:18-30.

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