浙江大学动物科学学院 李晓燕 肖英平 洪奇华 陈安国＊

变性梯度凝胶电泳 （denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术是1979年由Fischer和Lerman提出用于检测DNA突变的一种电泳技术。Muzyer等（1993）将DGGE实验技术应用于土壤微生物区系的研究，并证实该技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。近年来变性梯度凝胶电泳技术已得到迅速发展，被普遍应用于动物及人体微生物生态区系的研究（Pang等，2005）。随着畜牧科学的发展，DGGE结合PCR实验技术也广泛应用于动物科学研究中（何涛等，2008；吴高锋等，2008）。本文就PCR-DGGE技术的基本原理、实验流程，优缺点及其在畜牧科学中的应用进行概述。

1PCR-DGGE实验技术基本原理及流程

DNA分子双螺旋结构是氢键和碱基的疏水作用共同作用的结果，温度、有机溶剂和pH等因素都可以使氢键受到破坏，导致双链变性为单链。变性梯度凝胶电泳技术是根据DNA在梯度变性胶中具有的解链特性，不同序列的DNA片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时在各自相应的变性剂浓度（由尿素和甲酰胺组成的变性剂的浓度呈梯度上升）下变性从而分离。用PCR-DGGE技术研究微生物群落结构时，从混合菌群中提取总DNA，通过PCR扩增出细菌16S rDNA或18S rDNA基因的部分序列，得到片段大小相同但序列不同的目的片段混合物，在变性凝胶中进行电泳，双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置并达到其解链温度时，即开始部分解链，解链程度越大，迁移阻力越大，DNA分子的迁移速度随之减小，当产生的迁移阻力与电场力相平衡时，具有不同序列的DNA片段就停留在凝胶的不同位置，形成相互分开的条带图谱 （何涛等，2008；王凯，2007；Holben等，1998）。理论上只要选择足够精细的电泳条件，最低可检测到只有一个碱基差异的DNA片段（王凯等，2007），为了提高DGGE的检测敏感性，通常在一侧引物的5′端设计增加一个“GC夹板”（GC-Clamp，30 ～ 50 bp）（Holben 等，1998），电泳条带的数目和密度可分别反映细菌种类的多少和细菌的相对构成比例，对条带DNA进行分析即可获得微生物信息（Nakatsu，2007）。DGGE实验流程方式见图1。

2 PCR-DGGE实验技术在研究微生物菌群上的优势与局限性

图1 DGGE方法工作流程

在DNA分子技术出现之前，人们对肠道微生物的研究大多数是通过纯培养或直接形态观察，但是由于微生物形态简单不能提供太多的信息，并且肠道内微生物很多都是厌氧菌，只有少部分微生物能够被分离培养，若以这部分微生物来代表肠道中复杂的微生物菌群将导致很大的偏差（吴高锋等，2008）。PCR-DGGE实验技术可以很好地解决这一问题，它无需培养，故不受培养基的影响；不仅适用于通过普通培养方法得到的微生物，还能够分离到难以或无法用常规方法培养的微生物群落，以及混合微生物群落中含量很低的DNA序列；并且具有可靠、可重复、快速和易操作等特点（何涛等，2008）。若进一步将凝胶上的条带切割下来进行测序分析，与GenBank中的标准序列进行比较，便可以得出它们的遗传相关性。

PCR-DGGE技术也有自身的局限性，一是不能完整地体现全部的微生物群落，只能检测占整个群落微生物数量不低于1%的优势菌群（Omar和 Ampe，2000；Muzyer等，1997）； 二是无法确定分离的DNA片段在何位置发生的突变，也不能确定分离的DNA属于何种微生物，还需借助DNA测序分析；三是只能分离较小的片段 （最长只达l000 bp），这些序列只能提供有限的信息，片段太长时解离率下降，限制了用于系统发育分析和探针的序列信息量 （Nakatsu，2007； 吴高 锋等 ，2008）。

3 PCR-DGGE实验技术在畜牧研究中的应用

PCR-DGGE实验技术在畜牧科学研究的应用主要集中在对肠道及瘤胃微生物的分析，主要包括六方面：（1）饲料成分对肠道、瘤胃微生物结构及功能的影响；（2）抗生素或者益生素对肠道、瘤胃微生物结构及功能的影响；（3）环境应激等因素对肠道、瘤胃微生物结构及功能的影响；（4）动物不同发育阶段肠道、瘤胃微生物结构及功能的影响；（5）不同品种间肠道、瘤胃微生物的比较分析；（6）瘤胃细菌的遗传多样性分析。

3.1 PCR-DGGE实验技术在单胃动物研究中的应用

3.1.1 监测肠道菌落的动态性变化 动物日粮作为微生物最终代谢底物的来源，其成分和营养浓度的变化对微生物菌群的数量及多样性具有显著影响。Hume等（2003）采用PCR-DGGE技术研究了生长期和换羽期鸡肠道内微生物菌群变化的影响，结果表明，大于20日龄与小于20日龄的小鸡盲肠微生物菌群的相似性为51%，换羽和未换羽鸡盲肠微生物菌群的相似性为40%，并且发现低钙日粮或高锌日粮会降低鸡盲肠微生物的多样性。Zhou等（2007）研究不同剂量的维及霉素和亚甲基双水杨酸杆菌肽 （BMD）对不同日龄（3、7、14 d）的肉鸡肠道微生物的影响，结果表明，用抗生素处理的3日龄肉鸡回肠肠道球菌比未用抗生素处理的肉鸡丰富；乳酸杆菌的数量在3日龄和7日龄较少，而在14日龄显著增加；22 mg/kg的维及霉素对乳酸杆菌有抑制作用；预防性剂量的BMD对3日龄和7日龄肉鸡肠道乳酸杆菌均有抑制作用，对14日龄肉鸡肠道乳酸杆菌抑制作用不明显。胡平等（2010）研究不同形态玉米日粮对鹅肠道微生物区系的影响，玉米形态，尤其是整粒玉米日粮能够影响鹅肠道菌群分布，其中对空肠和回肠影响较大，对直肠的影响次之，对十二指肠和盲肠影响较小。

朱伟云等（2003）利用PCR-DGGE技术研究了仔猪断奶前后肠道和粪样微生物区系组成的变化，结果表明，仔猪断奶当天肠道和粪样DGGE谱带少，同窝仔猪间图谱相似，断奶后的DGGE图谱带逐渐增多，仔猪个体间DGGE图谱差异增大，仔猪是否同窝对DGGE图谱无显著影响；断奶后多样性指数较断奶前明显增加，而后微生物区系趋于多样且稳定。吴超等（2010）在早期断奶仔猪日粮中添加不同比例的中草药复方制剂，肠道菌群DGGE图谱显示中草药处理的仔猪直肠粪样相似性指数大于60%，0.5%中草药组仔猪微生物多样性最高；并通过DGGE图谱上的特异性条带发现有益菌的存在，说明复方中草药可以促进有益菌的生长，有效地改善断奶仔猪肠道微生物区系，进而有效降低腹泻率，减少应激反应。毛倩等（2010）在研究饲粮中添加复合益生素（Js菌0.1%和0.2%）对生长育肥猪盲肠菌群影响时发现，添加Js菌趋于增加盲肠内容物乳酸杆菌数量，减少大肠杆菌数量（P＞0.05），DGGE图谱相似性分析能反映样品间菌群相似度，抗生素组与对照组盲肠内容物菌群相似性较高 （相似性约85%），而添加JS的两组与二者相似性较低（相似性约57%），说明添加JS菌可使菌群种类和数量发生一定变化。

3.1.2 分析肠道菌群的多样性 研究比较不同品种、不同肠段间肠道微生物多样性差异常采用PCR-DGGE技术。曾志光等 （2010）采用PCRDGGE指纹图谱技术研究相同生长环境中不同品种猪肠道微生物群落差异与品种的关系，分析了荣昌猪、长白、杜洛克猪粪样中肠道微生物群落多样性，结果表明，荣昌猪肠道微生物群落多样性最高，荣昌猪与杜洛克猪的肠道微生物群落差异为37.3%，与长白猪的肠道微生物群落差异为31.8%。倪学勤等（2008）对不同周龄蛋鸡嗉囊，十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物细菌群落的结构和多样性进行了比较，肠道菌群DGGE图谱显示肠道部位对细菌种群结构影响很大，盲肠内微生物的多样性最高，其次是回肠和空肠，嗦囊和十二指肠的微生物多样性比较低；十二指肠内细菌与其他肠段相比差异最大，其次是盲肠。王金全等（2005）采用传统微生物培养和PCR-DGGE两种方法，针对肉仔鸡玉米-豆粕型、小麦-豆粕型和添加木聚糖酶的小麦-豆粕型3种日粮肠道内微生物数量和优势菌的多样性进行研究，小麦非淀粉多糖改变了肠道内微生物的种群结构，降低了菌群种属的数量（P＜0.05），添加木聚糖酶对回肠和盲肠的微生物种类以及菌群数量无显著影响（P ＞ 0.05）。

3.2 PCR-DGGE实验技术在反刍动物研究上的应用 Kocherginskaya等（2001）率先将 DGGE技术应用于瘤胃细菌群体结构的研究，分析了饲喂两种不同日粮的阉公牛瘤胃液样品的DGGE图谱，发现饲喂两种不同日粮的动物的DGGE图谱间存在显著差异。Belanche（2010）用DGGE凝胶电泳结合定量PCR来研究瘤胃微生物区系生物多样性的发展，监测羔羊在强饲的条件下生长的三个阶段哺乳期（30 d）、断奶期（45 d）和育肥期（90 d）网胃瘤胃微生物数量，在哺乳期30 d后纤维分解细菌数量明显增加，45 d和90 d后，生黄瘤胃球菌的数量减少而白色瘤胃球菌数量增加；原虫变化不规律，哺乳期有大量的内纤毛虫属微生物，但在断奶期消失。Kittelmann和Janssen（2011）使用PCR-DGGE等技术比较季节性日粮变化对新西兰家养羊、鹿和牛瘤胃中纤毛虫菌落组成的影响，不同的反刍动物饲喂相同饲料瘤胃的纤毛虫菌落变异程度呈现很大差异，羊的多样性指数最高，红鹿其次，牛最低；进一步的试验是由家畜自由采食改为集中饲喂青贮饲料和浓缩料，试验结果与前面一致；对于连续变化日粮的应激，牛的瘤胃纤毛虫菌落多样性表现得较为稳定，而羊和红鹿纤毛虫菌落组成变化较大。

王新峰等（2010）研究低聚异麦芽糖（IMO）和低聚果糖（FOS）对断奶羔羊瘤胃菌群的影响，采用DGGE技术对羔羊瘤胃内容物细菌16S rRNA的V6-V8可变区进行菌群多样性分析，并用实时定量PCR对细菌数量进行定量分析，结果表明，FOS显著降低了瘤胃菌群的多样性（P＜0.05），而IMO及混合低聚糖对瘤胃菌群的多样性无显著影响 （P＞0.05），两种低聚糖均显著降低DGGE凝胶上的条带数（P＜0.05），说明低聚糖能改变断奶羔羊瘤胃菌群多样性。刘圆圆（2010）通过变性梯度凝胶电泳分析水牛瘤胃产甲烷古菌的多样性，并对凝胶上不同水平位置的优势条带进行克隆测序，所得序列其中3条和甲烷短杆菌同源性达99%，1条与甲烷短杆菌同源性达98%，4条与古菌序列存在一定相似性。

采用PCR-DGGE技术分析不同的饲料处理方法对犊牛瘤胃细菌区系产生影响，在玉米和大豆经过膨化（PCON）、蒸汽压片（SFCS）及常规粉碎（对照组，NCON）的加工方式处理后，3组犊牛瘤胃中的细菌种群随年龄增长的组成情况基本一致，但SFCS组犊牛瘤胃中细菌的组成较其他2组相对复杂，反应蒸汽压片处理有助于犊牛瘤胃的发酵和发育（张元庆等，2010）。

3.3 PCR-DGGE实验技术在饲料生产研究上的应用 PCR-DGGE技术可用来监测微生物发酵原棉籽粕脱毒的过程，鉴定提取的DNA质量。汤江武等（2010）建立了一种以溶菌酶-SDS-蛋白酶K裂解棉籽粕发酵样品从中直接提取DNA的方法，通过对以本实验提取获得的DNA为模板扩增的16S rRNA-V3区产物进行DGGE分析，DGGE图谱中不同条带代表不同的细菌，条带的亮度表示该细菌的相对丰度，可以显示棉籽粕发酵过程中细菌群落结构发生了变化。

青贮饲料是反刍动物最重要的粗饲料之一，青贮的质量直接由青贮发酵的成功与否决定，所以了解青贮的发酵本质至关重要，一些学者开始应用分子生物学手段研究青贮中的乳酸菌。马俊孝（2006）利用PCR-DGGE在青贮中发现了植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum）和乳链球菌（Streptococcus lactis）。 韩吉雨等（2009a、b）利用V3区细菌通用引物对玉米青贮和苜蓿青贮不同发酵阶段进行PCR-DGGE分析，结果发现，苜蓿青贮各个时间点菌群变化不明显，玉米青贮0～3 d和7～60 d菌群由多急剧变少，两个阶段相似性小于50%；而利用引物（P2f和P3r）同样对玉米青贮和苜蓿青贮不同发酵阶段进行PCRDGGE分析，结果表明，苜蓿和玉米青贮两个发酵阶段菌群结构相似。虽然设计引物的不同导致结果不同，但是该研究表明了PCR-DGGE在监测饲料加工过程微生物变化中的重要作用。

4 小结与应用前景

从目前的发展趋势可以看出，分子生物学技术正逐步取代某些传统的研究方法而被广泛应用于微生物研究，而PCR-DGGE技术必将成为评价群体微生物种群结构和动态差异的有利技术手段，为了减少各种生物技术的偏差和局限性，DGGE还可以与其他方法结合起来，如糖和发酵产物分析、杂交技术、测序技术等。目前国内应用PCR-DGGE技术对肠道、瘤胃微生物，尤其是体外培养微生物的研究还处于初期阶段，应大力拓展DGGE技术应用范围，结合PCR、RT-PCR等其他分子生物学技术及微生物学方法，更准确地揭示微生物的多样性和开发更多的未知微生物遗传资源。

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