刘 斌，陈德才

大骨节病的国际通用名称为卡斯钦－贝克病(Kashin－Beck disease)，是一种地方性、畸形性骨关节病，基本病理改变为透明软骨变性、坏死，软骨基质降解丢失，最后出现继发性退行性骨关节病。T－2(trichothecene mycotoxin－2)毒素是镰刀菌在生长过程中产生的一种有毒代谢产物，为食物中常见的污染性霉菌毒素。在大骨节病区主食(主要是面粉和玉米)中检测到T－2毒素明显超标，而通过换用不含超标T－2毒素的粮食对大骨节病的防治有一定效果。因此，T－2毒素可能是大骨节病的病因之一[1]。笔者通过体外试验观察T－2毒素对软骨细胞增殖的影响，以探讨T－2毒素致关节损伤的具体机制，为T－2毒素致大骨节病学说进一步提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

奥林巴斯IX70倒置式相差/荧光显微镜(日本Olympus公司);HTS7000 Plus BioAssay Reader(美国PE公司);T－2毒素(Sigma公司);0.5%四甲基偶氮唑盐(成都鸿云科技公司);二甲基亚砜(上海启迪化工有限公司);由 L－谷氨酰胺、碳酸氢钠组成的DMEM/F－12液体培养基(Gibco11330)。

1.2 原代细胞培养

将2周龄新西兰白兔行颈椎脱臼处死，无菌切取四肢关节软骨，放入4℃的双抗液中漂洗2次，再放入4℃磷酸盐缓冲液中漂洗2次。用眼科小剪剪成糊状，转入小培养瓶中。加入0.25%的胰蛋白酶5 mL，在36.7℃恒温水浴箱中振荡消化30 min。加入10%小牛血清10 mL终止消化，转入10 mL离心管中，以1 000 r/min离心8 min。吸取上清液，加入含0.2%Ⅱ型胶原酶的DMEM/F－12培养基5 mL，如此反复数次，制成细胞悬液，转入25 cm2正方斜口细胞培养瓶中。5%CO2恒温孵箱37℃条件下培养，细胞呈贴壁生长。

1.3 软骨细胞鉴定

Ⅱ型胶原免疫组化染色法:待爬片的软骨细胞在盖玻片上长满后，倒去培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗，再用4%的中性甲醛固定30 min，以ABC法进行Ⅱ型胶原免疫组化染色，Ⅱ型胶原单克隆抗体作为一抗，浓度为25%。倒置显微镜下观察摄影。结果Ⅱ型胶原免疫组化染色为阳性，细胞胞浆可见棕黄色颗粒，细胞核着色不明显。

甲苯胺蓝染色法:待爬片的软骨细胞在盖玻片上长满后，倒去培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗，置于10%的中性甲醛溶液中固定过夜，再用70%的酒精固定20 min，0.04%的甲苯胺蓝染色20 min，迅速用无水乙醇漂洗1次，空气中干燥，倒置显微镜下观察摄影。结果甲苯胺蓝染色为阳性，细胞胞浆可见浅蓝色颗粒，细胞核着色不明显。

1.4 干预试验

调整细胞浓度为5×104/L，按每孔200μL接于96孔板，放入5%的CO2孵箱中37℃下培养，观察接种的软骨细胞贴壁生长情况。48 h后，软骨细胞完全贴壁，吸出96孔板中的原细胞培养液，分别加入质量浓度为1，10，20，100μg/L的 T－2培养液，试验组和对照组各200μL，其中试验组每组4个复孔，对照组每组3个复孔。培养1 d后，取出96孔板，取16孔，每孔加入20μL四甲基偶氮唑盐溶液，接着放入5%的CO2孵箱中37℃下培养3.5 h。取出96孔板，吸出每孔中液体，再每孔加入200μL二甲基亚砜，放入5%的CO2孵箱中37℃下培养30 min。取出96孔板，反复吹打上述16孔，使结晶完全溶解，吸出每孔中的液体，转入到另一96孔板，采用四甲基偶氮唑盐法检测，计算存活细胞相对数。分别于培养2，3，4，5 d时重复上述自“培养1 d后，取出96孔板……”开始的步骤。

1.5 统计学处理

所有数据均以均数±标准差(X±SD)的形式表示。应用SPSS 13.0软件对数据进行方差分析，P＜0.05表示有显著差异。

2 结果

随着T－2毒素质量浓度的增加，各组细胞生长抑制越来越明显，呈浓度依赖关系;随着作用时间的延长，T－2毒素对软骨细胞的抑制作用也逐渐增强，呈时间依赖关系。不同质量浓度T－2毒素对软骨细胞的抑制作用在试验第5天时接近饱和(表1)。

表1 不同质量浓度T－2毒素对软骨细胞增殖的影响(X±SD)

3 讨论

T－2毒素是一类单端孢霉烯族真菌毒素中有代表性的毒素，是食物中常见的污染性霉菌毒。自1967年Manning和Bonner利用胰蛋白酶和胶原酶将软骨细胞从软骨基质中分离出来后，研究者应用体外培养的软骨细胞在关节软骨疾病的发病机理方面进行了很多探索[2]。笔者用2周龄新西兰幼兔关节软骨成功培养了软骨细胞，并观察了T－2毒素对软骨细胞增殖的影响。结果T－2毒素质量浓度越高，软骨细胞增殖受抑制程度越重，主要原因是T－2毒素质量浓度越高，对软骨细胞DNA与蛋白质合成影响越大。另外，试验表明T－2毒素对软骨细胞的抑制作用在第5天时达到饱和，具体原因尚不清楚。但该试验至少说明，T－2毒素对软骨细胞体外最佳干预时间为5 d。根据试验结果推测，T－2毒素在大骨节病关节病变的形成中起着一定作用。

[1]杨建伯.大骨节病病因研究报告[J].中国地方病学杂志，1995，14(4):201－204.

[2]Gibson GJ，Verner JJ，Nelson FR，et al.Degradation of the cartilage collagen matrix associated with changes in chondrocytes in osteoarthrosis.Assessment by loss of background fluorescence and immunodetection of matrix components[J].Journal of Orthopaedic Research，2001，19(1):33－42.