刘 斌，陈德才

大骨节病的国际通用名称为卡斯钦－贝克病(Kashin－Beck disease)，是一种地方性、畸形性骨关节病，基本病理改变为透明软骨变性、坏死，软骨基质降解丢失，最后出现继发性退行性骨关节病。T－2(trichothecene mycotoxin－2)毒素是镰刀菌在生长过程中产生的一种有毒代谢产物，为食物中常见的污染性霉菌毒素。在大骨节病区主食(主要是面粉和玉米)中检测到T－2毒素明显超标，而通过换用不含超标T－2毒素的粮食对大骨节病的防治有一定效果。因此，T－2毒素可能是大骨节病的病因之一[1]。笔者通过体外试验观察T－2毒素对软骨细胞增殖的影响，以探讨T－2毒素致关节损伤的具体机制，为T－2毒素致大骨节病学说进一步提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

奥林巴斯IX70倒置式相差/荧光显微镜(日本Olympus公司);HTS7000 Plus BioAssay Reader(美国PE公司);T－2毒素(Sigma公司);0.5%四甲基偶氮唑盐(成都鸿云科技公司);二甲基亚砜(上海启迪化工有限公司);由 L－谷氨酰胺、碳酸氢钠组成的DMEM/F－12液体培养基(Gibco11330)。

1.2 原代细胞培养

将2周龄新西兰白兔行颈椎脱臼处死，无菌切取四肢关节软骨，放入4℃的双抗液中漂洗2次，再放入4℃磷酸盐缓冲液中漂洗2次。用眼科小剪剪成糊状，转入小培养瓶中。加入0.25%的胰蛋白酶5 mL，在36.7℃恒温水浴箱中振荡消化30 min。加入10%小牛血清10 mL终止消化，转入10 mL离心管中，以1 000 r/min离心8 min。吸取上清液，加入含0.2%Ⅱ型胶原酶的DMEM/F－12培养基5 mL，如此反复数次，制成细胞悬液，转入25 cm2正方斜口细胞培养瓶中。5%CO2恒温孵箱37℃条件下培养，细胞呈贴壁生长。

1.3 软骨细胞鉴定

Ⅱ型胶原免疫组化染色法:待爬片的软骨细胞在盖玻片上长满后，倒去培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗，再用4%的中性甲醛固定30 min，以ABC法进行Ⅱ型胶原免疫组化染色，Ⅱ型胶原单克隆抗体作为一抗，浓度为25%。……