徐 荣，吴 燕，刘丽平，苏欢欢

灵芝孢子粉是灵芝干燥成熟孢子破壁后的粉末，含有大量的核酸、核苷酸、多糖、蛋白质成分，具有扶正固本、健脾和胃、养心安神功效，用于心脾两虚、病后体弱以及肿瘤患者的辅助治疗[1]。笔者对国内两个厂家市售的灵芝孢子粉质量进行了比较，为医院制剂开发所需优质灵芝孢子粉原料药的选择提供依据，现报道如下。

1 仪器与试药

光学显微镜(重庆化学仪器厂);血球计数板(楚门光学仪器厂);KQ－300DE型数控超声波(昆山市超声仪器有限公司);BS110S型电子天平(中国北京);UV－2401 PC型紫外－可见分光光度计(日本岛津);RE－52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);微波炉(上海松下微波炉有限公司);101－A型数显电热鼓风干燥箱(上海沪南科学仪器厂);ZF－1型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂);硅胶G板(规格100 mm×200 mm，青岛海洋化学分厂)。灵芝孢子粉(北京A厂，批号为10020101;山东B厂，批号为20100308);灵芝对照药材(批号为120968－200906)、D－无水葡萄糖(批号为110833－200904)均购自中国药品生物制品检定所;石油醚(北京长海化工厂，批号为20080325);甲酸乙酯(化学纯，批号为T20071224)、苯酚(批号为100201)均购自国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇(北京化工厂，批号为20090103)。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别[2]

取灵芝孢子粉粉末2 g，加乙醇30 mL，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取灵芝对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚－甲酸甲酯－甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365 nm)检视。结果北京A厂与山东B厂生产的灵芝孢子粉均与灵芝对照药材在硅胶G薄层板上相同位置处显示相同颜色的荧光斑点(图1)。

图1 薄层色谱图

2.2 破壁率[3]

取灵芝孢子粉，置显微镜下观察。可见未破壁的孢子呈褐色，卵形，顶端平截，外壁无色，内壁有疣状突起;破壁后的孢子可见残破的孢子壁;在视野内计数破壁孢子与完整孢子的总数不少于100个，统计破壁孢子的比例。结果见表1。

2.3 水分测定

按2010年版《中国药典(一部)》附录ⅨH水分测定法第一法(烘干法)[4]测定。称取灵芝孢子粉2 g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过10 mm，精密称定，打开瓶盖在100～105℃干燥5 h，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30 min，再次精密称定，再在上述温度下干燥1 h，冷却，称重，计算连续两次称重差异(连续两次称重的差异不超过5 mg，即可不必继续进行干燥)。根据减失的质量，计算灵芝孢子粉的含水量。结果见表1。

2.4 总灰分含量

根据2010年版《中国药典(一部)》附录ⅨK总灰分的测定方法[4]进行灵芝孢子粉总灰分的测定。将灵芝孢子粉过二号筛，混合均匀后取2 g置炽灼至恒重的坩埚中，称定质量为2.002 7 g，缓缓炽热，注意避免燃烧，至完全炭化时逐渐升高温度至500～600℃，使完全灰化并至恒重，根据残渣质量计算灵芝孢子粉总灰分的含量。测定结果见表1。

表1 两个厂家生产的灵芝孢子粉比较(%)

2.5 灵芝多糖含量测定[5－6]

2.5.1 溶液制备

取灵芝孢子粉0.6 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加水50 mL，设定微波功率为400 W，提取10 min，放冷，再称定质量，加水补足减失的质量，摇匀，以3 000 r/min转速离心15 min，取沉淀加水溶解置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密称取D－无水葡萄糖18.4 mg，置25 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配置成质量浓度为0.736 g/L的D－无水葡萄糖对照品溶液。

2.5.2 多糖提取方法考察

传统提取方法:取灵芝孢子粉0.6 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加水50 mL，称定质量，加热回流3 h，放冷，再称定质量，加水补足减失的质量，摇匀，以3 000 r/min转速离心15 min，精密量取上清液2 mL，加无水乙醇8 mL，搅拌，以3 000 r/min转速离心15 min，取沉淀加水溶解，置10 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密称取2 mL供试品溶液，按照2.5.1项下方法处理样品后，在 λ=488 nm处测定吸光度，代入标准曲线方程并计算其提取率。

微波提取方法:取灵芝孢子粉0.6 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加水50 mL，设定微波提取时间和功率，提取完毕，放冷。此后操作同传统提取方法。精密称取2 mL供试品溶液，按照2.5.1项下方法处理样品后，在 λ=488 nm处测定吸光度，代入标准曲线方程并计算其提取率。设定微波辐射时间为10 min，分别考察200，300，400，550 W的微波功率，结果灵芝多糖提取率分别为86%，86%，96%，93%。因此，选择微波提取功率为400 W。设定微波辐射功率为400 W，分别设定微波提取时间为2，5，10，15 min，结果提取率分别为30%，94%，96%，88%。因此，选择提取时间为10 min。

比较:以传统提取方法提取，北京A厂的灵芝孢子粉提取率为52%，山东B厂为95%;以微波提取方法提取，北京A厂的灵芝孢子粉提取率为74%，山东B厂为99%。因此，选取微波提取方法提取灵芝多糖。

2.5.3 测定波长选择

精密移取D－无水葡萄糖对照品溶液2 mL，置具塞试管中，加新鲜配制的4%苯酚溶液1 mL，混匀加入7.0 mL硫酸，摇匀，于40℃水浴中保温30 min，取出置冰水浴中放置5 min，按上述方法配制不加药的溶液作为空白对照溶液，照2010年版《中国药典(一部)》附录ⅤA紫外分光光度法于200～800 nm波长范围内扫描，选择最大吸收波长488 nm为检测波长。

2.5.4 方法学考察

标准曲线绘制:精密移取对照品溶液 0，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，分别置 50 mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀。按照2.5.1项下方法处理样品，以第1份为空白，按分光光度法在488 nm波长处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标、质量浓度(C)为横坐标绘制标准曲线。经计算得回归方程 A=13.05C－0.017 5，r=0.999 1(n=8)。结果表明，葡萄糖质量浓度在 11.78 ～51.52μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验:精密量取D－无水葡萄糖对照品溶液2.0 mL，共6份，依法测定吸光度。结果的 RSD=0.75%(n=6)。

重现性试验:精密量取灵芝孢子粉0.6 g，共6份，依法配制供试品溶液并测定吸光度。结果的 RSD=1.74%(n=6)。

稳定性试验:精密量取供试品溶液2 mL，置具塞管中，分别加新鲜配制的4%苯酚溶液1 mL，混匀，迅速加入硫酸7.0 mL，摇匀。于40℃水浴中保温30 min，取出，置水浴中放置5 min，取出，分别于 0，0.5，1，2，4，6 h 时取样，依法测定吸光度。结果吸光度的平均值为0.324 7，RSD值为0.95%(n=6)，表明样品经上述处理后在6 h内稳定性良好。

加样回收试验:取供试品 0.3 g，精密称定，共 6份，按 2.5.2项下方法提取多糖至“取沉淀加水溶解，置10 mL量瓶中”，精密加入对照品溶液0.2 mL，用水稀释至刻度，摇匀，依法测定吸光度。结果见表2。

表2 加样回收试验结果(n=3)

2.5.5 样品含量测定

精密称取2 mL供试品溶液按照2.5.3项下方法处理样品后，在488 nm波长处测定吸光度代入标准曲线方程并计算其含量。测定结果见表1。

3 讨论

经比较，不同厂家产品的含量差异较大，山东B厂生产的灵芝孢子粉质量相对较优。这可能与不同厂家采用不同产地、不同生长季节的灵芝孢子粉为原料有关，因在不同生长季节灵芝中含灵芝多糖的含量不同;也可能与各厂家不同的灵芝多糖的提取工艺以及提取工艺的稳定性等因素有关。A厂总灰分的含量为3.37%，超标，因此应加强灵芝多糖的质量控制。

本试验通过比较传统工艺和微波方法分别提取灵芝多糖，结果发现传统工艺耗费时间较长，且提取率低。参考文献[7－8]有关微波提取灵芝多糖的方法，改用微波提取的方法优化提取工艺。微波具有提取效率高，耗时短的优点。通过单因素影响试验，考察了微波的功率和时间对提取效率的影响。结果表明，微波提取不仅在时间上大大缩短，而且提取率更高，具有较好的实际应用价值。

[1]李抒诗，于丽薇.灵芝中的化学成分及其药物作用和保健价值[J].中国医药指南，2009，7(4):108 －109.

[2]姚仲青，李文林，周 俊，等.灵芝孢子粉的质量研究[J].中药材，2007，30(5):608 － 611.

[3]倪伟锋，邢增涛，赵晓燕，等.破壁灵芝孢子粉破壁率测定的研究[J].上海农业学报，2008，24(3):45 －49.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录52－53.

[5]刘 敏，高 岚.紫外分光光度法测定灵芝孢子粉胶囊中灵芝多糖含量[J].现代中药研究与实践，2005，19(4):34 －36.

[6]程志英，吴 芳.灵芝孢子粉胶囊中多糖含量的测定[J].中国医院用药评价与分析，2009，9(7):524 －525.

[7]Chin CT，Swee NT，Jean WHY，et al.Evaluation of the extraction efficiency of thermally labile bioactive compounds in Gastrodia elata Blume by pressurized hot water extraction and microwave－assisted extraction[J].Journal of Chromatography A，2008(1 182):34－40.

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