李姝君，杨志雄，田鲜艳，苏文媚，唐 志，陈华林，黄 仲

广东医学院附属医院肿瘤中心，广东湛江 524001

近年来肺癌发病在世界范围内呈逐年上升的趋势，肺癌死亡占癌症死亡原因之首。因其早期症状不明显，无特异性，有2/3患者发现已是晚期，尽管联合应用手术、放疗、化疗、生物治疗等手段，但肺癌总体5年生存率约为16%[1]。本研究主要检测Survivin、Fas/FasL在肺癌中的表达，探讨其表达与肺癌的临床病理联系，以及Survivin表达与Fas/FasL表达和肿瘤细胞凋亡之间的相关性，为肺癌的临床诊断、治疗及靶向药物研发提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集广东医学院附属医院2006年10月～2008年11月手术切除并经病理证实的肺癌标本86例，NSCLC有81例，SCLC有5例。其中，男57例，女29例；年龄 40～79岁（其中≤60岁38例，＞60岁48例）；根据WHO《肺和胸膜肿瘤组织学分型标准》分类，其中，鳞癌37例、腺癌44例、小细胞癌5例；病理学分级：高分化18例，中分化36例，低分化27例，未分化5例；肺癌TNM分期根据2009年国际抗癌联盟（UICC）的分期标准进行分期，其中，Ⅰ期24例，Ⅱ期28例，Ⅲ+Ⅳ期34例（Ⅲ期31例、Ⅳ期3例）。另取30例肺癌病灶旁组织（远离癌灶部位3～5 cm，无癌细胞浸润的正常肺组织）及11例良性病变组织（支气管扩张4例、肺结核2例、多发囊肿1例、错构瘤1例、曲球菌病1例、真菌病1例、肺泡扩张1例）作对照。

1.2 方法

应用免疫组织化学SP法检测86例肺癌组织、30例癌旁肺组织、11例肺良性病变组织中Survivin、Fas、FasL基因的表达情况。

1.3 试剂

兔抗人Survivin、兔抗人Fas、FasL免疫组化多克隆抗体（即用型）及免疫组化SP超敏试剂盒购于福州市迈新生物技术开发公司。

1.4 结果判断标准

1.4.1 Sur vi vi n结果判定 阳性染色为棕黄色颗粒，胞质和胞核中均可出现表达。免疫组化染色强度分为弱阳性、中等阳性、强阳性，分别计为 1、2、3 分。选取 5 个高倍视野（×400），计数1 000个肿瘤细胞中阳性染色的细胞数，分为以下五个等级计分：0分，＜5%；1分，5%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，＞75%。以染色强度分值与阳性细胞数分值的相加为每一例的积分，积分为≤2者判定为目的基因表达阴性，积分＞2者为阳性。

1.4.2 Fas、Fas L结果判定 以细胞膜上或细胞质中出现棕黄色颗粒为标准。参照免疫组化染色强度判断标准，每个标本随机观察5个高倍视野（400×）计数1 000个肿瘤细胞中阳性染色的细胞数，以阳性细胞数量≥10%为阳性，＜10%为阴性。

1.5 统计学分析

数据采用SPSS 16.0统计软件包进行分析，样本率的比较采用R×C列联 χ2检验（Chi-square test）及四格表资料的确切概率法（Fisher′s exact test），相关性分析采用 Spearmans分析，以双侧检验水准P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Survivin、Fas、FasL在肺癌组织、癌旁组织、良性肺病变组织中的表达

见表 1～3。

表1 Survivin，Fas，FasL在不同组织中的表达

表2 Survivin表达与肺癌临床病理特征的关系

表3 Fas、FasL的表达与NSCLC临床病理特征的关系

2.3 肺癌组织中Survivin、Fas、FasL表达的相互关系

见表 4、5。

表4 肺癌组织中Survivin、Fas、FasL表达的相互关系（2×2配对资料）（例）

表5 肺癌组织中Survivin、Fas、FasL表达的关联性分析

3 讨论

Survivin是新近发现的凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protien，IAP）家族的一名新成员，是至今最强的凋亡抑制因子。具有抑制细胞凋亡，参与细胞周期调控作用，且与肿瘤细胞的分化增殖、血管形成及浸润转移相关，其选择性高表达在大多数恶性肿瘤中[1]。研究表明，在肺癌和其他恶性肿瘤中Survivin表达水平上调，其表达水平、定位和肿瘤的组织类型、细胞分化凋亡程度、TNM分期、侵袭转移，以及患者存活时间、预后有关，但各研究结果存在不一致性，总的研究结果表明，Survivin表达水平上调是一个不良预后指标。

本研究采用免疫组织化学SP法，检测了肺组织中Survivin蛋白的表达水平，其中包括86例肺癌组织、30例癌旁肺组织以及11例肺良性病变组织，结果显示，肺癌组织中Survivin阳性表达率为68.60%，而癌旁肺组织中Survivin阳性表达率为16.67%，肺良性病变组织中的阳性表达率为9.09%，差异有统计学意义（P＜0.01），该结果与大多数研究结果相近[2-3]。本研究还发现癌旁肺组织也有部分表达（16.67%），与其他学者研究结果一致[3-4]。

研究发现Survivin蛋白表达与肺癌患者的年龄、性别、病理类型无明显相关，但与TNM分期、淋巴结转移、病理学分级相关。有淋巴结转移Survivin表达率高；TNM分期越晚Survivin阳性表达率越高；低分化、未分化组Survivin阳性表达率高于中分化和高分化组。Akyurek、Liu等[3,5]研究也表明Survivin表达与淋巴结转移和预后相关，可能成为一个新的肺癌预后标志。Fan等[6]新近完成的一项Meta分析7例外科术后肺癌组织中Survivin表达情况与预后相关性研究，结果显示，Survivin过表达与患者总体生存期短相关。一项新的研究[7]应用RT-PCR、ELISA检测144例肺癌患者外周血液循环中癌细胞Survivin mRNA的表达，共有63例Survivin mRNA表达阳性与病理、临床分型相关，随访3年发现表达阳性患者比阴性患者有高复发率且生存期短。近几年关于Survivin表达定位研究也较多但结果争议较大，有研究表明Survivin在肿瘤细胞核阳性表达与不良预后和较短生存期相关[8]，而另有学者认为核阳性表达是一个好的预后标志[9]，也有报道肿瘤细胞质Survivin表达阳性与较差的预后相联系[10]。

Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。Fas抗原是细胞膜Ⅰ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子（TNF）超家族，FasL为Fas的配体（Fas Ligand）Ⅱ型膜蛋白。通过对肿瘤细胞Fas表达异常的分子机制研究发现，人类的许多恶性肿瘤可通过对基因突变、异常转录等方式，使得Fas表达下调、缺失或结果异常，从而使肿瘤细胞能够抵抗Fas介导的凋亡，得以生存与增殖。Fas/FasL异常表达或功能紊乱在肺癌的生长、转移和免疫逃逸等方面发挥着重要作用。本实验检测Fas在肺癌组织、癌旁肺组织、良性肺病变组织中阳性表达分别为：61.62%（小细胞肺癌为 40%）、76.67%、81.81%；肺癌组织表达低于癌旁和良性病变组织，但差异无统计学意义（P＞0.05）。FasL在肺癌织织、癌旁肺组织、良性病变组织中阳性表达分别为：63.95%（小细胞肺癌为80%）、16.67%、27.27%；FasL在肺癌组织阳性表达率高于癌旁肺组织阳性表达率（P＜0.05），实验结果与大多数学者研究结果一致。Kleinherg等[11]检测了121例肺癌患者（57例 NSCLC和64例小细胞肺癌）癌组织中Fas/FasL的表达，发现90%患者Fas表达明显减少，完全缺失的占24%，显著低于癌旁组织及正常肺组织。宿杰等[12]检测46例小细胞肺癌中FasmRNA阳性表达率为47.8%，明显低于在正常肺组织中的表达率（80%），FasL mRNA阳性表达率为58.7%，明显高于在正常肺组织中的表达率（35%）。本研究发现Fas表达与细胞分化程度呈正相关，分化越高Fas表达越高，与淋巴结转移、TNM分期、组织类型、年龄、性别等无相关性。表明在肿瘤细胞中随分化程度降低Fas表达水平下调，其凋亡减少、恶性程度增加，此可能为判断肺癌的预后提供一定参考，而FasL表达与肺癌TNM分期、淋巴结转移相关，淋巴结转移组FasL阳性表达明显高于无淋巴结转移组（P＜0.01），与临床病理学特征无明显相关性。表明肿瘤细胞通过表达FasL使癌细胞杀伤力增大逃避机体免疫监视，表达水平高其侵袭力和转移的可能性大。

本实验研究发现Survivin与Fas/FasL表达无明显相关性，笔者考虑其原因可能是两条凋亡路径中参与因子很多，两条凋亡路径中是否有交叉点，其参与因子间是否有相互作用还需深入研究以寻找更多的科学依据和理论支持，也有可能是Survivin的作用位点不在Fas表达的水平上。

[1]Ling X,Yang J,Tan D,et al.Differential expression of survivin-2B and survivin-DeltaEx3 is inversely associated with disease relapse and patient survival in non-small-cell lung cancer(NSCLC)[J].Lung Cancer,2005,49(3):353-361.

[2]Ichiki Y,Hanagiri T,Takenoyama M,et al.Tumor specific expression of survivin-2B in lung cancer as a novel target of immunotherapy[J].Lung Cancer,2005,49(2):281-289.

[3]Akyurek N,Memis L,Ekinci O,et al.Survivin expression in pre-invasive lesions and non-small cell lung carcinoma[J].Virchows Arch,2006,49(2):164-170.

[4]Karczmarek-Borowska B,Filip A,Wojcierowski J,et al.Survivin antiapoptotic gene expression as a prognostic factor in non-small cell lung cancer:in situ hybridization study[J].Folia Histochem Cytobiol,2005,43(4):237-242.

[5]Liu XL,Tao XJ,Yuan J,et al.The expression and significance of Survivin and Ki67 in odontogenic jaw cyst epithelium[J].JChn Stomatol,2009,25(2):91-93.

[6]Fan J,Wang L,Jiang GN,et al.The role of survivin on overall survival of non-small cell lung cancer,ameta-analysis of published literatures[J].Lung Cancer,2008,61(1):91-96.

[7]Yie SM,Lou B,Ye SR,et al.Clinical significance of detecting survivinexpressing circulating cancer cells in patients with non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2009,63(2):284-290.

[8]Shinohara ET,Gonzalez A,Massion PP,et al.Nuclear survivin predicts recurrence and poor survival in patients with resected nonsmall cell lung carcinoma[J].Cancer,2005,103(8):1685-1692.

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[10]Kren L,Brazdil J,Hermanova M,et al.Prognostic significance of antiapoptosis proteins survivin and bcl-2 in non-small cell lung carcinomas:a clinicopathologic study of 102 cases[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2004,12(1):44-49.

[11]Kleinherg L,Florenes VA,Silins I,et al.Nuclear expression of survivin is associated with improved survival in metastatic ovarian carcinoma[J].Cancer,2007,109(2):228-238.

[12]宿杰,赵志龙,黄青远,等.Fas/FasLmRNA在小细胞肺癌石蜡包埋组织中的表达及其临床意义[J].中国现代医学杂志,2008,11(18):3245-3248.