李明 李岩 陈伟强 余雪松

CD24是一种低分子量高度糖基化的蛋白质粘附分子，作为P-选择素的配体之一，CD24参与介导单核细胞、中性粒细胞与内皮细胞、血小板之间的粘附。近年来，临床研究发现CD24高表达于多种肿瘤细胞表面，并且与肿瘤的预后密切相关［1］。对于其作用机制，以往研究较多的集中的CD24与肿瘤转移的关系上，而CD24在肿瘤增殖中的作用研究尚不十分明确。因此，本实验用siRNA干扰CD24的表达，观察抑制CD24表达对细胞的增殖的影响，初步探讨CD24在肿瘤生长中的作用。

1 资料与方法

1.1 试剂与仪器 引物、分子量Marker和质粒提取试剂盒(大连 TaKaRa公司);两步法 RT-PCR试剂盒、Trizol、Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司);抗CD24抗体和抗βactin抗体(美国Santa Cruze公司);ECL化学发光试剂盒(美国Pierce公司);蛋白电泳仪、电转仪、杂交箱和酶标仪(美国Bio-Rad公司)。人黑色素瘤细胞株B16F10为本室保存。靶向CD24的siRNA干扰质粒pSi-CD24由本室构建，按试剂盒说明书提取备用［2］。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 取对数生长期的人黑色素瘤细胞B16F10细胞，接种于6孔细胞培养板内，待细胞达到80%融合时，按照说明书用脂质体Lipofectamine 2000转染细胞。实验分为对照组和pSi-CD24组。

1.2.2 B16F10细胞中CD24 mRNA表达的变化 转染24 h后，用Trizol法提取细胞总RNA，按照说明书以Oligo-d(T)18为引物逆转录合成第一链cDNA，用特异性引物扩增CD24和β-Actin。引物序列和扩增方法见本课题组前期发表的论文［2］。PCR产物用1.5%琼脂糖电泳，拍照，观察。

1.2.3 B16F10细胞中CD24蛋白表达的变化 转染48 h后按照试剂盒操作步骤提取细胞总蛋白，取20 μg样品煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%的脱脂奶粉37℃封闭1 h，加抗 CD24(1∶1000)或抗 β-Actin(1∶1000)单克隆抗体，4℃孵育过夜，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的相应二抗稀释液(1∶3000)37℃孵育1 h，ECL法显影，常规洗片拍照。

1.2.4 pSi-CD24对B16F10细胞增殖的影响 取空白对照组和pSi-CD24组细胞细胞，接种至96孔板上，各组设4孔，在转染后 0、24、48 和 72 h 后加入 MIT(5 mg/m1)20 μl，用MTT法检测细胞增殖情况，并绘制细胞生长曲线。

2 结果

2.1 pSi-CD24对CD24 mRNA和蛋白表达的影响 RT-PCR和Western blot结果显示，在正常情况下，黑色素瘤细胞B16F10高表达CD24，而转染重组质粒pSi-CD24后，B16F10细胞中CD24 mRNA和蛋白水平的表达均明显降低，说明重组质粒pSi-CD24能抑制CD24的表达。结果见图1。

图1 重组质粒pSi-CD24对B16F10细胞CD24表达的影响

2.2 pSi-CD24对B16F10细胞增殖的影响 MTT结果显示，转染pSi-CD24质粒后，黑色素瘤细胞B16F10的增值明显被抑制，在48 h和72 h与对照组差异有统计学意义。结果见图2。

图2 重组质粒pSi-CD24对B16F10细胞增殖的影响

3 讨论

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种简单有效的基因沉默工具，主要通过诱导序列特异性的mRNA降解，从而产生相应的功能表型缺失，现已被广泛应用于基因治疗和功能基因组学的研究中［3］。在哺乳动物细胞的RNAi研究中，通过质粒等表达载体在细胞内直接转录形成siRNA具有经济和容易操作、作用持续时间长等优点，是目前siRNA最常用的方法。我们前期采用具有RNA聚合酶Ⅲ启动子的pSilencer 3.1载体，成功构建了靶向CD24基因的表达载体pSi-CD24［2］。本实验用 RT-PCR和 Western blot在黑色素瘤细胞B16F10中发现，转染pSi-CD24质粒后细胞CD24在mRNA水平和蛋白水平的表达较对照组均有明显降低，说明pSi-CD24可以在细胞内持续表达siRNA，高效特异地抑制CD24的表达，为进一步研究CD24基因的功能和以CD24为靶点进行肿瘤治疗奠定了基础。

作为P-选择素的配体，CD24高表达能增强肿瘤的侵袭能力和转移能力［4］。研究发现，在病理情况下CD24和P-选择素介导了肿瘤细胞与血小板及内皮细胞的粘附与结合，肿瘤细胞与血小板结合后，形成血小板血栓，可以保护肿瘤细胞逃避免疫监视，降低免疫细胞对肿瘤的杀伤效应;肿瘤细胞和内皮细胞的粘附则有助于肿瘤细胞从循环系统转移到组织中形成转移灶，因此，CD24/P-选择素的结合被认为与肿瘤转移密切相关。还有研究证实CD24也介导了肿瘤细胞与纤维粘连蛋白等细胞外基质的粘附作用，敲除CD24可以降低SW620细胞的粘附能力［5］。CD24对肿瘤的生长也具有调控作用，Smith等发现敲除CD24基因导致肿瘤细胞凋亡增加［6］。有学者认为这与CD24能促进肿瘤微血管形成有关，也有研究认为与CD24促肿瘤细胞生长有关。本实验利用siRNA技术敲除黑色素瘤B16F10细胞CD24基因表达，发现抑制CD24表达可以降低细胞的增值能力，说明CD24可能通过某些信号途径促进肿瘤细胞增殖，进一步证实了上述结果。

综上所述，CD24在多种肿瘤中高表达，与肿瘤的生长、粘附和转移密切相关，抑制CD24表达可以降低肿瘤细胞的增殖能力、诱导肿瘤细胞凋亡、阻碍肿瘤的转移，因此CD24可能是一个治疗肿瘤的新靶点，但对其作用机制尚需进一步的深入研究。

［1］邹萌萌，吴诚义.CD24与乳腺癌及其干细胞的研究进展.中国普通外科杂志，2008，17(5):480-483.

［2］李明，龚水明，李岩，等.靶向CD24的siRNA表达载体构建及其沉默效应的研究.解剖学研究，2010，32(3):174-177.

［3］Mello CC，Conte D Jr.Revealing the world of RNA interference.Nature，2004，431(7006):338-342.

［4］Friederichs J，Zeller Y，Hafezi-Moghadam A，et al.The CD24/P-selectin binding pathway initiates lung arrest of human A125 adenocarcinoma cells.Cancer Res，2000，60(23):6714-6722.

［5］邓启亮，王新颖，王伟飞，等.抑制CD24表达对SW620细胞粘附能力影响的研究.数理医药学杂志，2010，23(2):156-159.

［6］Smith SC，Oxford G，Wu Z，et al.The metastasis-associated gene CD24 is regulated by Ral GTPase and is a mediator of cell proliferation and survival in human cancer.Cancer Res，2006，66(4):1917-1922.