李剑敏 周国兴 宋海鹏 何志军 张斌

熊果酸(ursolic acid，UA)又名乌索酸、乌苏酸，是广泛存在于芦笋、白花蛇舌草、女贞子、乌梅等天然植物和草药中的五环三萜类化合物，具有抗癌、抗炎、护肝、降血脂、降糖、抗氧化和抗病毒等多种生物学活性。近来研究表明，抗肿瘤活性是熊果酸最主要的药理作用，抗肿瘤作用具有多方面和全方位等特点［1］。研究证明，熊果酸对肺癌细胞 A-549、胃癌SGC7901、白血病细胞P-388、L-1210和THP-1等均具有细胞毒性作用［2］，但其作用机制一直未明确。本实验拟用熊果酸干预处理人急性早幼粒白血病HL60细胞，体外培养实验，进一步研究其对HL60细胞的增殖抑制、诱导凋亡作用及机制。

1 资料与方法

1.1 材料 急性早幼粒白血病HL60细胞由南华大学药物药理研究所惠赠。UA为Sigma公司产品，用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，配制成1 mmol/L的浓缩液，冻存于-20℃，临用前用培养基稀释并调整DMSO终浓度为0.06%。四甲基偶氮唑蓝［MTT］为Amresco公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将HL60细胞常规培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，置37℃、5%CO2培养箱中传代培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 增殖抑制实验 HL60细胞以2×104/孔接种于96孔板，用 0、10、20、40 、80 μmol/L UA 分别处理 24、48、72 h 后，加入5 g/L MTT作用4 h。4℃离心，弃上清，加入DMSO振荡溶解后，用荧光酶标仪于570 nm波长下读取吸光度值，以0 μmol/L UA组为对照组，计算增殖抑制率，增殖抑制率=［(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/对照组吸光度值］×100%。

1.2.3 荧光显微镜细胞形态学观察 HL60细胞经0、20、40、80 μmol/L UA 分别作用24 h后，800 g/min离心5 min，收集细胞，PBS洗涤，调整细胞数至2×105个/ml，吹打均匀，取25 μl悬液加到载玻片上，加5 μl吖啶橙染色后置荧光显微镜(波长250～350 nm)观察细胞形态。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期相分布及细胞凋亡率 取对数生长期 HL60细胞用0、20、40 、80 μmol/L UA 分别作用24 h，800 g/min离心5 min，收集5×106个细胞，预冷 PBS洗涤一次，加入70%预冷乙醇，4℃固定过夜。离心弃乙醇，PBS洗涤一次后加入RNA酶(1 mg/ml)200 μl，37℃水浴30 min后，加入 500 μl PI(50 mg/L)，4℃避光染色30 min，流式细胞仪进行检测。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件，以均数±标准差()表示，采用t检验P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖抑制试验 MTT检测显示10～80 μmol/L UA对HL60细胞具有一定增殖抑制效果，且呈较明显的浓度和时间依赖性(见图1)，10、20 μmol/L UA对HL60细胞的作用微弱，40、80 μmol/L UA作用24 h后，HL60细胞呈现明显的增殖抑制。

图1 UA对HL60细胞的增殖抑制作用

2.2 细胞生长抑制的形态学变化 AO染色后，荧光显微镜下观察，未用药的细胞生长良好，80 μmol/L UA作用24 h的HL60细胞可看到典型的细胞凋亡形态学变化(图2):细胞染色质浓缩，聚集于核边缘形成块状或新月状;细胞体积缩小，核固缩深染，部分裂解形成凋亡小体。

2.3 流式细胞术检测细胞周期和凋亡率 UA作用24 h后，与对照组(0 μmol/L) 相比，40 μmol/L 、80 μmol/L UA 可使G0/G1期细胞增多，出现G0/G1期阻滞，S期和G2/M期细胞数减少，凋亡细胞峰(Sub-G1)及凋亡率逐渐增高，凋亡率与对照组相比均差异有统计学意义(P＜0.05)(图3)。

图2 荧光显微镜观察UA作用24 h后HL60细胞的形态改变

图3 流式细胞仪检测不同浓度UA作用24 h后HL60细胞的凋亡率

3 讨论

熊果酸属于α-香树脂醇(α-amyrin)型五环三萜类化合物，存在于许多植物中，具有广泛的生物学活性，不仅对多种致癌、促癌物有抵抗作用，而且对多种恶性肿瘤细胞有明显细胞毒作用和诱导分化作用。樊明文等［3］研究表明，熊果酸通过抑制舌鳞癌细胞株TsCCa的增殖来发挥抗肿瘤作用;赵晓燕等［4］报道，熊果酸对胃癌BGC823细胞具有增殖抑制及诱导凋亡作用;Cha HJ等［5］对侵袭性最强的HT1080纤维瘤细胞进行研究，发现熊果酸可以通过胞浆内糖皮质激素受体的移位下调人纤维肉瘤HT-1080细胞基质金属酶-9(MMP-9)基因的表达，从而降低纤维瘤的侵袭性。这些研究在一定程度上揭示了熊果酸的抗肿瘤效应，但具体的抗瘤机制一直未得到明确。

本次研究以人急性早幼粒白血病HL60细胞为研究对象进行体外培养，熊果酸干预处理，细胞增殖抑制实验(MTT)表明:10～80 μmol/L UA对HL60细胞具有一定增殖抑制效果，且呈浓度和时间依赖性。10、20 μmol/L UA对HL60细胞的作用微弱，40 μmol/L起开始具有较明显的作用。80 μmol/L UA作用24 h的HL60细胞AO染色后荧光显微镜下可看到典型的细胞凋亡形态学变化:细胞染色质浓缩，聚集于核边缘形成块状或新月状;细胞体积缩小，核固缩深染，部分裂解形成凋亡小体。UA处理24 h后，流式细胞检测结果显示G0/G1期细胞增多，出现G0/G1期阻滞，S期和G2/M期细胞数减少，凋亡细胞峰(Sub-G1)及凋亡率逐渐增高，说明熊果酸体外可诱导HL60细胞发生凋亡来产生抗肿瘤活性。熊果酸诱导肿瘤细胞凋亡的具体途径可能是干扰了细胞信号通路中的某些环节有关，有待进一步开展更深层次的研究。

［1］夏国豪.熊果酸抗肿瘤作用研究进展国外医学.肿瘤学分册，2002，29(6):420-422.

［2］Lee KH，Lin YM，Wu TS，et al.The cytotoxic principles of Prunella vulgaris，Psychotria serpens and Hyptis capitata:Ursolic acid related derivatices.Planta Med，1998，54:308-311.

［3］樊明文，王茜，边专，等.熊果酸对人舌鳞癌细胞株TSCCa的抑制作用及其机制探讨武汉大学学报(医学版)，2004，25(1):1-3.

［4］赵晓燕，胡玉娜，康向东，等.熊果酸诱导人胃癌BGC823细胞凋亡及其作用机制初探中国癌症杂志，2010，20(2):101-104.

［5］Cha HJ，Bae SK，Lee HY，et al.Anti invasive activity of ursolic acid correlateswith the reduced exp ression ofmatrixmet allop rotein2 ase-9(MMP-9)in HT1080 human fibrosarcoma cells.Cancer Res，1996，56(10):2281-2284.