于 硕， 赵晓东， 张丽莉， 张文杰， 程建新

(1.河北医科大学第二医院河北石家庄 050000;2.河北医科大学第四医院河北石家庄 050011)

癌症是目前临床危害人类健康和导致死亡的主要疾病。癌因性疲乏(Cancer-Related Fatigue，CRF)是癌症患者最常见的主观症状之一，可由癌症引起，或是癌症治疗的结果。癌症患者的疲乏发生率为34% ～76%，接受化疗的病人有75%～96%会产生疲乏，且持续时间长，极大地影响患者的生活质量，成为治疗和康复的重要影响因素。因此，探索癌因性疲乏的病理生理机制以制定出行而有效的预防和治疗的策略是非常有必要的。目前提出的疲乏病因机制假说包括:5-羟色胺(5-HT)失调，迷走传入神经的激活，肌肉的改变和ATP代谢异常，下丘脑-垂体-肾上腺轴功能异常和24 h节律异常以及促细胞素失调。机体活动主要是指骨骼肌的运动，而骨骼肌的活动需要能量供应才能实现，能源物质在机体主要以ATP(三磷酸腺苷)的形式存在，可以为多种细胞功能活动提供能量尤其是肌肉细胞的活动。ATP是在机体的‘能量加工厂’——线粒体中生成的，在线粒体内表面附着许多小颗粒，它们是三磷酸腺苷酶，参与能量的转换，因此说线粒体是营养物质氧化代谢产生能量的主要细胞器，它存在于肌细胞内可将人体中的糖原、葡萄糖、自由脂肪酸等能源物质进行代谢反应，生成直接能源ATP供机体活动所需［1-3］。所以在骨骼肌中线粒体的多少、大小、形状等均反映了机体肌肉的功能状态，从而反映了肌肉是否疲劳及疲乏程度。在我国传统医学中疲劳也是常见的临床症状，常被描述为‘懈惰、四肢劳倦、四肢不欲动、神疲乏力’等，按中医脏象学说，躯体的乏力及易疲劳与脾、肝、肾三脏有直接关系，因此运用调理肝脾、补气理气的培本扶正中药有助于消除疲乏［4］。本实验将就此加以研究和验证。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/C裸鼠130只，雌雄兼用，体质量26～28g，6周龄，由中国药品生物制品检定所实验动物资源中心提供(实验动物合格证号SCXK(京)2005-0004)。饲养于河北医科大学分子生物学研究所SPF级动物室内。

1.2 细胞株

人胃癌BGC-823细胞株，由河北医科大学第四医院肿瘤研究所提供，取2.5×106/mL细胞浓度，0.2 mL/只行裸鼠注射。

1.3 实验器材

水迷宫(中国医学科学院药物研究所研制);开阔箱(本实验依有关文献制作);透射电镜(日本电子JEM-1230);高效液相色谱仪;配SPD-10Avp紫外检测器、7725i定量进样器装置、C18色谱柱(LC-10ATvp日本岛津公司)

1.4 实验药物

参芪扶正注射液(丽珠集团利民制药厂生产);250 mL/支，含党参、黄芪、氯化钠等;国药准字Z19990065。

5-氟尿嘧啶注射液(天津金耀氨基酸有限公司生产)0.25 g/10mL/支，国药准字 H12020959。

三磷酸腺苷(标准品，Sigma公司产品)。

2 方法

2.1 癌因性疲乏动物模型的建立

2.1.1 分组:把裸鼠随机分为正常对照组(10只)、模型对照组(30只)(其中轻度疲乏组10只、中度疲乏组10只、重度疲乏组10只)、治疗组(90只)(其中轻度疲乏组30只、中度疲乏组30只、重度疲乏组30只，每组再分3个治疗小组，分别是参芪扶正注射液注射组、5-氟尿嘧啶注射组、参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组，每组各10只)。

2.1.2 动物模型的建立:⑴将冻存于液氮中BGC-823细胞取出，解冻培养，使用细胞计数板计数，按照2.5×106/mL细胞浓度，0.2 mL/只注射到裸鼠。⑵裸鼠饲养于室温(22±2)℃、正常光照的SPF级动物室中5只/笼，按照50 mg/kg的剂量以氯胺酮行腹腔注射麻醉裸鼠，常规消毒皮肤，沿左侧正中旁线切开，刀口约1.0 cm，小心暴露腹膜与胃壁，用一次性注射器将肿瘤细胞注射于胃壁浆膜层，缝合腹壁及皮肤。⑶以钴60灭菌饲料喂养，每日观察裸鼠的饮水量、进食量、体质量、皮毛色泽、日常活动及粪便情况。在出现活动减少、皮色变暗、体质量减轻、饮水进食量减少时，开始行为学方面的测定以了解疲乏程度。⑷ a、学习记忆情况的观测(水迷宫):此实验可作为脑力疲乏的评定标准之一，可根据出离迷宫时间的不同来判定疲乏的程度:轻度疲乏约为(89.69 ±26.38)s，中度疲乏约为(113.62 ±33.72)s，重度疲乏约为(136.44 ±41.56)s。b、旷场实验(开阔法):此实验可作为脑力疲乏的评定标准之一(观察裸鼠在开阔箱正中格内的活动情况，包括在正中格停留时间、方格间穿行次数即三爪以上跨入临格的次数、竖起时间即两前肢离地1cm以上的时间)。c、鼠尾悬挂实验:此实验可作为体力疲乏的评定标准之一(观察裸鼠在倒挂状态下6 min内的不动时间)。d、力竭游泳实验:此实验可作为体力疲乏的评定标准之一(记录裸鼠从入水到头部沉入水中10 s不能浮出水面的时间)。依据此四试验将疲乏程度分为轻度、中度和重度疲乏。

2.2 治疗药物的应用

在判定裸鼠出现疲乏及评定分级后，对治疗组裸鼠进行药物经鼠尾静脉注射，依注射药物的不同分为参芪扶正注射液注射组、5-氟尿嘧啶注射组、参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组，此分组相当于培本扶正治疗组、化疗组、培本扶正联合化疗组。各组注射剂量为参芪扶正注射液4 g/kg(相当于2 mL/kg)(此剂量与临床常用剂量250 mL/天/人是相当的)，5-氟尿嘧啶25 mg/kg(相当于1 mL/kg)，均连续注射5 d，而后进行ATP水平检测和电镜观察。

2.3 取材及样本处理

摘除裸鼠眼球，由眼后静脉取血后处死裸鼠，在放有冰块的搪瓷盘中迅速剪开下肢皮肤，取出腓肠肌，按电镜标本制作要求制作(详见腓肠肌超微结构观察)。血液予以低速离心(4 000 r/min，10 min)，取上清液以1∶1滴入乙腈，充分混匀，在4℃离心机离心(12 000 r/min，5 min)，取上清液备用。

2.4 ATP水平的测定:高效液相色谱法

高效液相色谱配合样品衍生化后用荧光检测器分析波长，流动相为甲醇-醋酸钠=15∶85(V∶V)，波长260 nm，进液量为10 μL，用外标法定量。

2.5 腓肠肌超微结构观察

取材、固定、脱水、包埋、切片染色后进行透射电镜观察、拍片、记录。

2.6 统计学方法

统计软件采用SAS6.0分析，实验结果均以平均值±标准差(±s)表示，组间差异采用方差分析，用Q检验。P＜0.05，有统计学意义。

3 结果

3.1 ATP 测定结果

各疲乏状态治疗组裸鼠的血浆ATP水平均低于正常对照组。见表1。

表1 各治疗组中ATP水平的比较 (ng/mL)

3.1.1 轻度疲乏组:各治疗组裸鼠的血浆ATP水平均低于正常对照组。

参芪扶正注射液注射组与正常对照组比较、与参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组比较、与模型对照组比较均为P＜0.05，有显著差异;与5-氟尿嘧啶注射组比较P＜0.01，有明显差异。

参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组与正常对照组比较，P＜0.01，有明显差异;与5-氟尿嘧啶注射组比较、与模型对照组比较均为P＜0.05，有显著差异。

5-氟尿嘧啶注射组与正常对照组比较，P＜0.01，有明显差异;与模型对照组比较P＜0.05，有显著差异。

模型对照组与正常对照组比较P＜0.01，有明显差异。

3.1.2 中度疲乏组:各治疗组裸鼠的血浆ATP水平均低于正常对照组。

参芪扶正注射液注射组与正常对照组比较、与5-氟尿嘧啶注射组比较均为P＜0.01，有明显差异;而与参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组比较、与模型对照组比较均为P＜0.05，有显著差异。

参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组与正常对照组比较，P＜0.01，有明显差异;与5-氟尿嘧啶注射组比较、与模型对照组比较均为P＜0.05，有显著差异。

5-氟尿嘧啶注射组与正常对照组比较，P＜0.01，有明显差异;与模型对照组比较，P＜0.05，有显著差异。

模型对照组与正常对照组比较，P＜0.01，有明显差异。

3.1.3 重度疲乏组:各治疗组裸鼠的血浆ATP水平均低于正常对照组。

参芪扶正注射液注射组与正常对照组比较、与5-氟尿嘧啶注射组比较均为P＜0.01，有明显差异;与参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组比较、与模型对照组比较均为P＜0.05，有显著差异。

参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组与正常对照组比较，P＜0.01，有明显差异;与5-氟尿嘧啶注射组比较、与模型对照组比较均为P＜0.05，有显著差异。

5-氟尿嘧啶注射组与正常对照组比较，P＜0.01，有明显差异;与模型对照组比较，P＜0.05，有显著差异。

模型对照组与正常对照组比较，P＜0.01，有明显差异。

3.2 腓肠肌超微结构的电镜观察 均为(×20K)电镜下观察。

3.2.1 正常对照组可见肌原纤维排列整齐、肌节正常、线粒体在肌原纤维间成对排列且外膜完整，见图1。

图1 正常对照组腓肠肌超微结构

3.2.2 轻度疲乏组:轻度疲乏单用参芪扶正注射液注射组和轻度疲乏应用参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组在镜下表现基本相同:可见肌原纤维间轻度水肿，线粒体个别肿胀明显，局部嵴消失，仅在后者个别外膜不完整;模型对照组和轻度疲乏单用5-氟尿嘧啶治疗组在镜下表现基本相同:可见肌原纤维间轻度水肿，线粒体多数肿胀明显，局部嵴消失，个别外膜不完整，线粒体成对排列现象消失，排列紊乱，仅在后者见部分肌节旁线粒体缺失，见图2。

3.2.3 中度疲乏组:中度疲乏单用参芪扶正注射液注射组可见肌原纤维间个别线粒体肿胀，局部嵴消失，部分嵴排列稀疏，外膜尚完整，但肌原纤维间轻度水肿;中度疲乏应用参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组和模型对照组在镜下均可见肌原纤维间排列紊乱，不同程度的肌丝溶解，线粒体多数肿胀明显，局部嵴消失，个别外膜不完整，部分肌节旁线粒体缺失，线粒体排列紊乱，外形不规整，线粒体成对排列现象消失;中度疲乏单用5-氟尿嘧啶治疗组可见肌原纤维不连续，肌丝溶解，线粒体多数肿胀明显，大部分嵴排列紊乱、消失，大部分线粒体外膜不完整，部分肌节旁线粒体缺失，线粒体排列紊乱，外形不规整，线粒体成对排列现象消失，见图3。

图2 轻度疲乏组腓肠肌超微结构

图3 中度疲乏组腓肠肌超微结构

3.2.4 重度疲乏组:重度疲乏单用参芪扶正注射液注射组可见肌原纤维间水肿，部分肌节旁线粒体消失，部分线粒体肿胀明显，嵴丰富，外膜完整;重度疲乏应用参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组可见肌原纤维间水肿，大部分线粒体肿胀，外膜不完整，局部的嵴排列紊乱、消失;模型对照组和重度疲乏单用5-氟尿嘧啶治疗组可见不同程度的肌原纤维不连续，肌丝溶解，线粒体多数肿胀明显，外膜不完整，部分肌节旁线粒体缺失，大部分线粒体嵴排列紊乱、消失，见图4。

图4 重度疲乏组腓肠肌超微结构

4 讨论

现代生理学研究认为机体的日常活动是依靠骨骼肌的一系列收缩舒张的细胞学机制来完成实现的。此机制包括两个主要方面:㈠骨骼肌收缩:①兴奋—收缩耦联:首先肌细胞膜的兴奋(动作电位)沿肌细胞膜以局部电流的形式传播，沿肌细胞的横管系统传入肌细胞的深部，导致三联管兴奋，使纵管系统的终末池对Ca2+的通透性增加，Ca2+由终末池释放到细胞浆中，使细胞浆Ca2+浓度瞬间升高100倍，Ca2+扩散并与细丝中的肌钙蛋白结合，肌钙蛋白分子空间构型改变，失去固定作用，使细丝中的原肌球蛋白从其阻碍位置上移开，从而暴露细丝中的肌动蛋白分子上横桥的结合位点，使横桥与肌动蛋白结合，触发横桥摆动。②横桥摆动引起肌小节中粗细肌丝相互滑行，横桥循环摆动包括以下四个步骤:⑴粗肌丝上获能的肌球蛋白横桥与肌动蛋白结合;⑵这种结合触发了储存于肌球蛋白中的能量释放，导致每个横桥产生一个角运动;⑶ATP与肌球蛋白结合，打破了肌动蛋白和肌球蛋白的结合，允许横桥与肌动蛋白解离;⑷结合到肌球蛋白上的ATP通过内源性分解，将能量传递给肌球蛋白的横桥，产生一种获能的横桥。以上循环不断重复，导致肌小节中粗细肌丝不断滑行，使肌肉收缩。㈡收缩的肌肉舒张:对肌肉的刺激终止，肌细胞膜电位回复静息电位，纵管系统的终末池对Ca2+的通透性降低，同时启动了终末池上的Ca2+泵，依靠ATP分解放能将细胞浆中的Ca2+泵回终末池内，使细胞浆中的Ca2+浓度降低，导致肌钙蛋白与Ca2+解离，肌钙蛋白重新将原肌球蛋白固定于肌动蛋白上横桥的结合位点上面，阻断了横桥与肌动蛋白的结合，导致肌肉舒张。由此可见，肌肉的收缩和舒张都有赖于ATP功能，因此ATP的缺乏势必将导致肌肉收缩和舒张功能的障碍［5-7］。

生物能量学认为线粒体在生命活动中具有主要的作用，被称为‘生物钟’故线粒体的老化是细胞衰弱的一种表现和重要原因［8］。同时线粒体也是真核细胞内的一种重要和独特的细胞器，是细胞进行呼吸链、电子传递、三羧酸循环和氧化磷酸化的场地，其中有氧呼吸是线粒体中可控制的一个通过Krebs循环使还原态有机复合物氧化产生CO2的过程，在Krebs循环过程中，释放的电子通过含有4个呼吸复合体的电子传递链传递，最终把CO2还原为H2O，自由能随着电子传递而释放，用于产生跨越线粒体内膜的质子梯度，最后储存于质子梯度中的势能驱动ATP合酶使ADP磷酸化产生ATP，这是所有线粒体所共有的呼吸作用的基本功能［9-11］。故线粒体是动物细胞内主要的ATP生产中心，能生成细胞生命活动所需的能量，其病变影响细胞各成分的协调并危及细胞生命活动。由此可见，线粒体的结构和功能状态影响着ATP的生产，是机体肌肉活动正常与否的标志。

由ATP测定结果可见在轻度、中度和重度疲乏状态的各治疗组的裸鼠中，ATP的水平均低于正常对照组的裸鼠，且有统计学意义(轻度疲乏参芪扶正注射液注射组与正常对照组比较P＜0.05，轻度疲乏参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组、5-氟尿嘧啶注射组、模型对照组与正常对照组比较P＜0.01，中度和重度疲乏各治疗组与正常对照组比较P＜0.01)。而在各级疲乏状态的裸鼠中，参芪扶正注射液注射组的ATP水平高于参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组、5-氟尿嘧啶注射组和模型对照组(轻度、中度和重度疲乏组P＜0.05);参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组的ATP水平高于5-氟尿嘧啶注射组和模型对照组(轻度、中度和重度疲乏组P＜0.05);模型对照组的ATP水平高于5-氟尿嘧啶注射组(轻度、中度和重度疲乏组P＜0.05)。由此可见，在疲乏状态下的裸鼠在应用参芪扶正注射液治疗后，ATP水平得到提升，而应用5-氟尿嘧啶治疗后，ATP水平反而比模型对照组的还低，说明作为培本扶正补气理气的中成药——参芪扶正注射液确实具有增强机体机能，改善疲劳状态，恢复机体体力，固元培本的效能［12］;而5-氟尿嘧啶作为化疗药物在机体出现疲乏状态后继续应用，可使机体的疲劳程度进一步加重，影响机体的康复，如确需应用5-氟尿嘧啶治疗可联合参芪扶正注射液协同治疗，可达到减弱5-氟尿嘧啶毒副作用，缓解疲劳的目的。

由腓肠肌超微结构电镜观察结果可见在轻度、中度和重度疲乏组裸鼠的腓肠肌电镜显示肌原纤维均有不同程度的间隙水肿、纤维断裂不连续和肌丝溶解(轻度疲乏组变化最轻，重度疲乏组变化最重);显示线粒体均有不同程度的体积肿胀、肌节旁成对线粒体缺失、嵴排列紊乱和消失、外膜不完整等(轻度疲乏组变化最轻，重度疲乏组变化最重);而在各级疲乏状态下的各治疗组中显示单用参芪扶正注射液注射组的肌原纤维和线粒体的改变好于参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组，参芪扶正注射液和5-氟尿嘧啶联合注射组的改变好于模型对照组，模型对照组的改变好于5-氟尿嘧啶注射组。这与ATP水平的测定结果相一致，从微观角度也说明参芪扶正注射液对于癌因性疲乏具有一定的治疗作用，体现在改善线粒体的功能状态，增加ATP的水平。从另一方面来讲，肌肉改变和ATP水平的减少可作为出现癌因性疲乏的病因之一［13-15］。

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