邹 禹， 李 卿， 秦 剑

(1.重庆市第九人民医院，重庆 400700;2.重庆市中药研究院，重庆 400065)

小儿和胃利脾颗粒是在多年使用的临床验方基础上，经现代工艺制成的中药复方制剂，本品由鸡内金、山药、三七、黄芪等药材组成，临床证实具有开胃健脾功效，用于小儿脾虚胃弱，食欲不振，营养不良，发育迟缓，面色萎黄等症。本研究用薄层色谱法在同一色谱条件下对制剂中的三七、黄芪进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定三七中的有效成分三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、黄芪中黄芪甲苷，结果准确可靠，可用于该制剂的质量控制与评价控制成分。

1 仪器与试药

1100高效液相色谱仪(美国惠普公司)，Waters2695液相色谱仪(美国 Waters公司)，Alltech 2000ES型蒸发光散射检测器(美国奥泰公司)，薄层成像色谱仪(瑞士卡玛公司);三七皂苷R1对照品(批号:0745-9804)、人参皂苷 Rb1对照品(批号:0703-200118)、人参皂苷Rg1对照品(批号:110704-200318)、黄芪甲苷对照品(批号:0781-9807)，供定量测定用，均由中国药品生物制品检定所提供;硅胶G(青岛海洋化工厂，薄层层析用);小儿和胃利脾颗粒(本院自制);乙腈为色谱纯;水为去离子水;其余试剂均为分析纯。

2 三七、黄芪的薄层鉴别

取本品4 g，加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 mL使溶解，用水饱和正丁醇提取4次，每次20 mL，合并水饱和正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次40 mL，弃去氨试液，水饱和正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述5种溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图1。

图1 三七、黄芪薄层色谱图1.缺黄芪阴性样品 2-4.小儿和胃利脾颗粒 5.缺三七阴性样品6.黄芪甲苷对照品 7.混合对照品 8.三七皂苷R1对照品9.人参皂苷Rb1对照品 10.人参皂苷Rg1对照品Fig.1 TLC of Notoginseng Radix et Rhizoma and Astragali Radix1.negative sample without Astragali Radix 2-4.samples 5.negative sample without Notoginseng Radix et Rhizoma 6.astragaloside IV 7.mixed reference substances 8.notoginsenoside R1 9.ginsenoside Rb1 10.ginsenoside Rg1

3 三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1定量测定

3.1 色谱条件 色谱柱 Phenomenex C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱;体积流量为1.0 mL/min;检测波长203 nm;柱温30℃。理论板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4 000。

表1 梯度洗脱Tab.1 Gradient elution

3.2 供试品溶液的制备 取本品约3 g，精密称定，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 mL使溶解，用水饱和正丁醇提取4次，每次20 mL，合并水饱和正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次40 mL，弃去氨试液，水饱和正丁醇液蒸干，残渣用甲醇适量使溶解，移置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，取续滤液，即得。

3.3 对照品溶液的制备 精密称取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rg1对照品适量，加甲醇制成每1 mL含三七皂苷R10.21 mg、人参皂苷 Rb10.38 mg、人参皂苷 Rg10.35 mg的混合溶液，即得。

3.4 阴性对照样品溶液的制备 取不含三七的阴性样品适量，按供试品溶液制备方法制备阴性对照样品溶液。

3.5 系统适用性试验 精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液和阴性对照溶液各10 μL，依照上述色谱条件测定。阴性对照溶液在混合对照品相同保留时间位置上未见色谱峰，说明阴性无干扰。见图2。3.6 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2、4、8、16、20 μL，注入液相色谱仪，以峰面积积分值为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，分别得回归方程。结果见表2。

表2 线性回归方程 (n=5)Tab.2 Equations of linear regression (n=5)

3.7 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定峰面积值，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷 Rg1峰面积的 RSD分别为0.78%、0.85%和 0.90%(n=6)。表明仪器精密度良好。

图2 高效液相色谱图A.对照品 B.供试品 C.缺三七阴性供试品 1.三七皂苷R12.人参皂苷Rg13.人参皂苷Rb1Fig.2 HPLC chromatogramsA.reference substance B.sample C.negative sample without Notoginseng Radix et Rhizoma 1.notoginsenoside R1 2.ginsenoside Rg1 3.ginsenoside Rb1

3.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、1、4、8、10、12 h 进样，三七皂苷 R1、人参皂苷 Rb1、人参皂苷Rg1峰面积的RSD分别为0.88%、0.97%和0.95%(n=6)。结果表明，供试品溶液在12 h内稳定性良好。

3.9 重复性试验 精密称取同一批样品6份，照供试品溶液制备方法，测定，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1质量分数RSD分别为1.04%、1.16%和0.97%(n=6)，表明本试验方法重复性良好。

3.10 加样回收率试验 精密称取已测定的同批样品6份，分别精密加入三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1对照品适量，照供试品溶液制备方法，按确定的色谱条件测定，计算回收率，结果见表3。

3.11 样品测定 称取供试品3.0 g，精密称定，制备供试品溶液，按3.1项下色谱条件，测定。结果见表4。

表3 加样回收率试验结果 (n=6)Tab.3 Results of revovery test(n=6)

表4 样品测定结果 (n=3)Tab.4 Results of sample determination (n=3)

4 黄芪甲苷测定

4.1 色谱条件 色谱柱:Waters symmetry C18色谱柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈-水(30∶70);体积流量为0.8 mL/min;检测器蒸发光散射检测器;漂移管温度70℃;柱温30℃。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于5 000。

4.2 供试品溶液的制备 取本品约5 g，精密称定，加甲醇40 mL，超声处理35 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水25 mL使溶解，用水饱和正丁醇提取4次，每次30 mL，合并水饱和正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次60 mL，弃去氨试液，水饱和正丁醇液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，通过D101型大孔树脂柱(2.5 g，内径 1 cm)，以水60 mL 洗脱，弃去过柱液及水洗液，再用20%乙醇50 mL洗脱，弃去洗脱液，继用60%乙醇50 mL洗脱，收集60%乙醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇适量使溶解，移置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，取续滤液，即得。

4.3 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.38 mg的溶液，即得。

4.4 阴性对照样品溶液的制备 取不含黄芪的阴性样品适量，按供试品溶液制备方法制备阴性对照样品溶液。

4.5 系统适用性试验 精密吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各10 μL，测定。阴性对照溶液在黄芪甲苷对照品相同保留时间位置上未见色谱峰，且与相邻色谱峰分离度大于1.5，说明阴性无干扰。见图3。

图3 高效液相色谱图A.对照品 B.供试品 C.缺黄芪阴性供试品 1.黄芪甲苷Fig.3 HPLC chromatogramsA.reference substance B.sample C.negative sample without Astragali Radix 1.astragaloside IV

4.6 线性关系考察 精密吸取对照品溶液4、8、12、16、20 μL，进样，以对照品进样量的对数值为横坐标、峰面积的对数值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 lnA=1.570 0lnC+12.263 3，r=0.999 9(n=5)。结果表明黄芪甲苷进样量在1.52～7.60 μg范围内的对数值与峰面积的对数值呈良好的线性关系。

4.7 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定峰面积，黄芪甲苷峰面积的RSD为0.92%(n=6)。表明仪器精密度良好。

4.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、1、3、6、8、10 h 进样，黄芪甲苷峰面积的 RSD 为0.73%(n=6)。表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

4.9 重复性试验 精密称取同一批样品6份，照供试品溶液制备方法，测定，黄芪甲苷含量 RSD为1.02%(n=6)，表明本试验方法重复性良好。

4.10 加样回收率试验 精密称取已测定的同批样品6份，分别精密加入黄芪甲苷对照品适量，照供试品溶液制备方法，按确定的色谱条件测定，计算回收率，结果见表5。

4.11 样品测定 称取供试品5 g，精密称定，制备供试品溶液，按4.1项下色谱条件，测定。结果见表6。

5 讨论

本品的薄层色谱鉴别方法系在同一色谱条件下同时鉴别三七、黄芪成分，尚未见文献报道;本方法均以阴性样品为对照，结果表明各薄层斑点不受样品中其他各药的干扰，专属性强，简单易行，可作为本品定性检测指标。

表5 加样回收率试验结果 (n=6)Tab.5 Results of revovery test(n=6)

表6 样品测定结果 (n=3)Tab.6 Results of sample determination (n=3)

本制剂由三七，黄芪、山药等药材提取制成，样品成分复杂，含皂苷类物质较多，采用高效液相色谱法测定三七中主要成分。对供试品溶液的提取方法进行比较，采用中性氧化铝吸附法、大孔树脂吸附法、水饱和正丁醇萃取法、正丁醇萃取法，试验结果表明，采用水饱和正丁醇萃取法，后用氨试液洗涤，方法操作简便，定量测定结果准确，重复性好，可用于本制剂中三七的质量控制。

对制剂中黄芪的有效成分黄芪甲苷测定，采用蒸发光散射检测器检测，对样品的前处理进行研究，采用D101型大孔树脂纯化供试品溶液，并用不同浓度乙醇梯度洗脱，供试品纯化效果明显，经方法学研究结果表明，本定量测定方法能够用于本制剂中黄芪的质量控制，为制定本制剂的质量标准提供了理论依据。

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