韩晓萍， 叶正良， 王薇丹， 李德坤， 周大铮， 林瑞超， 刘丽芳

(1.青海省药品检验所，青海西宁 810000;2.天津天士力之骄药业有限公司，天津 300402;3.中国药品生物制品检定所，北京 100150;4.中国药科大学，江苏 南京 211198)

中药制剂化学成分复杂，种类繁多，本身又多为大分子物质，这些大分子如蛋白质、多肽、糖、鞣质、果胶等既有免疫原性，又具有免疫反应性，因此具有致敏的可能性［1］。中药注射剂直接作用于静脉，起效快，但是一旦有副作用，就会产生严重的后果［2］。2009年7月，国家食品药品监督管理局出台了《中药注射剂安全性再评价质量控制要点》，明确要求对于具体品种的工艺条件下可能存在、而质量研究中未检出的大类成分，应建立排除性检查方法，必要时，应建立高分子量物质检查项。注射用益气复脉(冻干)是在传统古方生脉散的基础上研制而成的新型中药制剂，由红参、麦冬和五味子组方而成，具有益气生津、敛阴止汗的功效。本研究正是基于这一要求展开，建立了一种简便快捷的方法检测注射用益气复脉(冻干)中的大分子物质。确保制剂的安全性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，G1310A单元泵，G1322A在线脱气机，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱，G1362A示差检测器，Mettle Toledo XS105电子天平。

1.2 试药 右旋糖苷对照品(Dextran Standard，相对分子质量分别为 180，2 500，4 600，7 100，10 000，21 400，41 100，84 400，133 800。中国药品生物制品检定所，批号2000-01)。水为重蒸水，氯化钠为分析纯。注射用益气复脉(冻干)5批(批号分别为20080201、20080402、20080702、20090204、20090302、天津天士力之骄药业有限公司提供)，氯化钠注射液(批号:9G71C，中国大冢制药有限公司，市售)。

2 方法与结果［3］

2.1 色谱条件 色谱柱为 Ultrahydrogel 250(7.8 mm×300 mm);流动相0.1 mol/L氯化钠溶液;体积流量0.3 mL/min;柱温30℃;示差折光检测器40℃。进样量20 μL。

2.2 专属性和线性考察 精密称取上述9份对照品用氯化钠注射液配制成各约1 mg/mL的溶液，同时取氯化钠注射液作空白对照溶液，分别进样，按上述条件测试，图谱见图1。以保留时间tR为横坐标，右旋糖酐分子质量的lgMW为纵坐标［4］进行回归处理，得线性回归方程为:lgMW= －0.208 6tR+8.918，r=0.991，测定结果见表1。

图1 9种不同分子质量右旋糖酐对照品及空白对照的液相图谱Fig.1 Chromatogram of nine molecular weight dextrans and background

表1 9种不同分子量右旋糖酐对照品的保留时间Tab.1 tRof nine molecular weight dextrans

结果表明:空白对照溶液在相应的保留时间处均无干扰，右旋糖苷标准溶液在相对分子质量180～133 800范围内相对分子质量与保留时间呈良好的线性关系。

2.3 精密度考察 精密称量相对分子质量为4 600和10 000的右旋糖酐对照品，分别用氯化钠注射液溶解定容，得浓度为1.96 mg/mL和2.07 mg/mL的溶液，分别连续进样6次，测定保留时间，计算RSD，结果相对分子质量为4 600的右旋糖酐保留时间的RSD为0.83%，相对分子质量为10 000的RSD为1.06%。表明此方法的精密度良好。

2.4 最低检出限 取上述配制的右旋糖苷4 600和1 000对照品溶液，分别稀释至10倍、120倍、200倍、400倍、500倍，进样分析，色谱图见图2。

图2 不同浓度2种右旋糖苷最低检测限对照品色谱图Fig.2 The limit of detection of two dextrans

结果表明，二者在稀释到500倍时，样品峰消失，故可判断右旋糖苷对照品的最低检出限为约4 μg/mL。

2.5 稳定性考察 取上述两种右旋糖酐对照品溶液，分别放置0、2、4、8 h后按上述条件进样测定，计算保留时间的RSD，结果相对分子质量为4 600的右旋糖酐保留时间的RSD为0.57%，相对分子质量为10 000的 RSD为0.72%，表明此方法的稳定性良好。

2.6 样品测定 分别取5批注射用益气复脉(冻干)用氯化钠注射液配制成浓度约为1.0 mg/mL的溶液，微孔滤膜滤过，20 μL进样测定。样品色谱图见图3。

图3 5批注射用益气复脉(冻干)的测定色谱图Fig.3 Chromatogram of five batches of injection(freeze-drying)

结果表明所测5批注射用益气复脉(冻干)样品的出峰时间均高于30 min，可判断样品中无大分子物质或含量极低。

2.7 样品稳定性考察 精密称取批号为20080201注射用益气复脉(冻干)，用氯化钠注射液溶解并定容至 0.65 mg/mL。分别考察在 0、2、4、8 h 放置后样品在注射用氯化钠注射液中的稳定性。所测液相图谱见图4。

图4 样品在辅助注射液中的稳定性Fig.4 Stability of sample in auxiliary injection

结果表明:样品溶解于氯化钠注射液中后在8 h内测定没有出现大分子物质，样品在此辅助注射溶剂中稳定性良好。

2.8 结果 依据凝胶色谱的分离原理:相同实验条件下，物质的分子质量越大，保留时间越短;分子质量越小，保留时间越长［5］。示差折光检测器是高度稳定和灵敏的液相色谱和凝胶渗透色谱检测器，可用于检测在紫外光范围内吸光度不高的化合物，如聚合物、糖、有机酸和甘油三酸酯［6］。示差折光检测器的偏转式设计，能够对那些具有低噪音和位移特性的化合物进行灵敏的检测。从HPLC图谱中可知所测5批注射用益气复脉(冻干)样品出峰时间高于30 min，可判断注射用益气复脉(冻干)中无大分子物质或含量极低。

3 分析与讨论

3.1 对于中药注射剂中的大分子物质的排除性检测方法的确立，目前尚无法规性的方法可参照，本研究中的方法学验证以《中国药典》2010版一部附录ⅩⅧ中药质量标准分析方法验证指导原则为基础。

3.2 中药注射剂致机体过敏物质很多，一般分为完全抗原和半抗原两种，完全抗原多为大分子物质，相对分子质量大于10 000，如动物蛋白、多肽等，进入人体内能直接使人体致敏;半抗原为小分子化学物质，而大多数中药为低分子质量化合物，进入人体后必须先与某些大分子物质如蛋白质等作为载体相结合，才能形成半抗原-载体复合物，引起机体对该种药物的特异性免疫反应［7-9］。故本研究中选择相对分子质量为5 000(实际为4 600)和10 000的两个右旋糖酐对照品做方法学验证。

3.3 因为是大分子物质的排除性检测，故在本研究中对精密度、最低检测限和稳定性的考察均用对照品的相应测定表示。

3.4 注射用益气复脉(冻干)在临床使用时规定用氯化钠注射液做辅助注射剂，故本研究中选择用氯化钠注射液做相应溶剂和空白对照。

3.5 分别比较了0.1 mol/L氯化钠溶液、0.7%硫酸钠溶液、0.1%叠氮化钠作流动相之后，在以氯化钠注射液做溶剂时0.1 mol/L氯化钠溶液做流动相效果更好［4，10］。

3.6 本研究附带考察了样品在辅助注射剂中溶解之后的稳定性，以说明样品在用氯化钠注射液中溶解后8 h内没有发生聚凝和沉淀等变化。

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