李 军 杨慧玲 (郑州大学第一附属医院药学部,河南 郑州 450052)

天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是从葫芦科植物栝楼的块根中提取的一种蛋白质,为我国传统中药“天花粉”的有效成分,具有引产、抗肿瘤和抗免疫缺陷病毒(HIV)等多种生物学功能〔1,2〕。TCS属于单链核糖体失活蛋白(ribosomeinactivatingprotein,RIP),以往的研究主要集中在其引起细胞凋亡及相关基因表达方面。本文观察 TCS对宫颈癌 Hela细胞增殖的抑制作用,从细胞自噬的角度探讨TCS的抗肿瘤作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 宫颈癌细胞株Hela细胞购自武汉大学典藏中心,用含 10%小牛血清的 DMEM培养基(Gibco公司),在 5%CO2、37℃条件下培养,每 3d传代 1次。取对数生长期细胞进行实验。TCS为江苏天晴制药总厂产品,Beclin1和微管相关蛋白轻链 3(LC3)抗体购自美国 Santa Cruz公司,异硫氰酸荧光素(FITC)标记的IgG购自武汉凌飞公司,胆囊收缩素(cell counting kit,CCK-8)试剂盒由日本 Dojindo Laboratories生产;其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法检测 TCS对 Hela细胞增殖的抑制作用 取对数生长期 Hela细胞接种于 96孔板上(细胞数为每孔 1×105个),待细胞贴壁分别加入不同浓度的TCS,每个浓度设 6个复孔,对照组加入相同体积的培养液,继续培养 24、48、72 h,每孔加入 10μl CCK-8试剂,于 37℃、5%CO2培养箱孵育 1h,使用酶标仪检测 450 nm波长处吸光度值(A),以空白对照孔调零,按下列公式计算细胞生长抑制率:细胞生长抑制率 =(A对照组-A实验组)/A对照组。

1.2.2 单丹磺酰尸胺(MDC)荧光染色检测细胞自噬变化选择抑瘤效果明显的药物浓度 80μg/ml分别给药 3、6、12、24 h,使用含 MDC(0.05mmol/L)的新鲜培养基孵育 15 min,离心洗涤 2次后涂片,使用荧光显微镜加 356 nm发射滤片和545nm断滤片进行观察、摄片。……