杨 玮 徐道华

(广东医学院药理教研室，广东 湛江 524023)

间充质干细胞(mesenchymal cells，MSCs)是近年来发现的一种易于扩增、具有多种分化潜能的细胞，在不同的诱导条件下，能够向成骨细胞，成软骨细胞，成肌细胞、脂肪细胞及基质细胞等不同的细胞系分化〔1〕。MSCs的成骨分化受到多重信号通路的调控，如何定向诱导其成骨分化是解决骨组织工程中种子细胞来源的一个重要前提。近年来的报道称Wnt经典途径对生理成骨是必需的〔2〕。无论Wnt信号分子的表达增强还是Wnt抑制因子的缺失都将导致骨形成的增强。低密度脂蛋白受体相关蛋白(LPR5)获得性功能突变会导致高骨量表型，而缺失性功能突变将引起骨质疏松〔2〕。另外骨髓腔内的成骨细胞和脂肪细胞均来源于MSCs，二者具有相同的细胞表型，在一定条件下可以互相转换，并且存在彼消此长的关系〔3〕。很多转录因子，细胞内信号通路调节两者的分化。比如，成骨分化主要受runx相关转录因子2(runx-2)的控制，而过氧化物酶增殖体激活受体(PPARγ)则是主要的成脂因子〔4〕。

1 Wnt信号通路研究简介

目前，在哺乳动物中已发现19种Wnt基因，分别命名为Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a等等。它们编码的 Wnt蛋白分子大约包括350～400个氨基酸〔5〕，且都带有一段由23～24个半胱氨酸构成的保守区，这些区域显示出20% ～80%的同源性。Wnt蛋白合成后，经由糖蛋白修饰，与人卷曲蛋白Fzd结合〔6〕。这一受体家族现已发现10个成员，分别由500～700个氨基酸组成。Fzd的共受体，即低密度脂蛋白相关受体，LPR5和LPR6是分别含有1 615和1 613个氨基酸的跨膜蛋白。Fzd亦可与单跨膜的酪氨酸激酶样跨膜受体(ROR2)结合〔7〕。Wnt蛋白与膜受体结合后可导致下游信号的激活，产生不同的生物学作用。这一信号通路包括三条途径:经典 Wnt/β-连环蛋白(βcatenin)通路、Wnt/Ca2+和Wnt/平面细胞极化(PCP)通路，后两者又合称为非经典信号途径。

2 经典Wnt信号通路与MSCs成骨分化

2.1 经典Wnt信号通路 经典信号通路包括一个重要的调节子β-catenin。当缺乏 Wnt配体时，β-catenin与核心蛋白(Axin)!大肠腺瘤样蛋白(adenmatous polyposis coli，APC)结合后被酪蛋白激酶 Iα(CKIα)和糖原合成激酶 3β(GSK3β)磷酸化〔8〕，最终被泛素/蛋白激酶途径降解。这样一来，β-catenin就无法激活转录过程，T细胞因子(TCF)与抑制子组蛋白去乙酰化酶(HDAC)作用，抑制 Wnt靶基因的转录〔9〕。

若Wnt蛋白与共受体Fzd，低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP5/6)结合，胞内信号调节因子(Dvl)将被CKIε磷酸化，LRP5/6-体轴发育抑制因子(Axin)-FRAT复合物形成后将Axin降解〔10〕，β-catenin就从 APC-Axin-GSK3β 复合物上解离了下来，避免了被分解的命运。这样一来，积累的β-catenin就会与相关转录因子结合，活化Wnt靶基因的转录。

2.2 经典Wnt信号通路在MSCs成骨分化中的作用 经典Wnt信号通路对MSCs成骨分化的促进、抑制作用均见报道。最初有人发现，经典通路共受体LRP5的功能突变引起骨量改变，即LRP5缺失性功能突变导致骨量减少和家族性骨质疏松，而LRP5获得性功能突变将形成高骨密度表型〔11〕。接着又有β-catenin信号促进了MSCs成骨分化的报道出现〔12〕。后来，在TCF上发现存在Runx2启动子的活化激活位点，猜测β-catenin/TCF/LEF复合物可能对Runx2的表达有一定作用〔13〕。

Boland〔14〕与 Boer等〔15〕分别发现，含有 Wnt3a 的条件培养基或经慢病毒转染Wnt3a都将强烈抑制人MSCs成骨分化。外源性的Wnt1也可急剧下调成骨标志物的表达〔15〕，如碱性磷酸酶，骨钙素等。这一结果与先前发现的Wnt通路在体内骨动态平衡中的阳性作用相矛盾。Ross等〔16〕发现经典Wnt信号通路亦可抑制成脂分化。那么，是否在经典Wnt通路中，人MSCs更倾向于成骨分化，这仍然是一个有待解决的问题。Liu等〔17〕发现100 ng/ml Wnt3a可不完全抑制成骨，而在含有25 ng/ml Wnt3 a的培养基中则完全观察不到碱性磷酸酶(ALP)活性或矿化抑制的现象。相形之下，Wnt3 a抑制成脂分化的能力似乎更强烈一些，5 ng/ml就可达到40%的抑制率，100 ng/ml则可达到完全抑制。在含有Wnt蛋白的双向(成脂成骨)培养基中，Liu等〔17〕比较了人MSCs成脂成骨的敏感性，结果表明，人MSCs成脂成骨敏感性的不同将改变原有的平衡状态，有可能使得人MSCs更倾向于成骨方向分化。Kahler等〔18〕发现Wnt经典通路对成骨的抑制作用归根结底是β-catenin-Lef复合物对Runx2转录活性的抑制。但Gaur等〔13〕在鼠MSCs中又发现Wnt/β-catenin增加了Runx2水平。Liu等〔17〕的结论是高浓度的Wnt蛋白将下调成骨转录因子的表达。因此得出结论:体外实验中，Wnt经典途径对人MSCs的成脂成骨的调节能力与细胞所处的微环境中Wnt蛋白的含量有关。可以肯定的是，通过对Wnt蛋白的适当调节，可达到控制人MSCs的成脂成骨分化的目的。另外，Wnt蛋白作用下MSCs成脂成骨敏感性的不同，也为一定浓度的Wnt蛋白可抑制MSCs成脂分化，倾向成骨分化提供了依据。

3 非经典Wnt信号通路与MSCs成骨分化

3.1 非经典Wnt信号通路简介 非经典Wnt信号通路即βcatenin非依赖途径，主要作用于细胞的运动和极化过程，包括Wnt/PCP及Wnt/Ca2+通路。Wnt/PCP通路主要包含在个体发育过程中，包括蛋白酪氨酸激酶(JAK)/STAT信号的激活。这一途径中的Wnt5a、Wnt11和 Wnt7a与Fzd、ROR2相互作用，并结合散乱蛋白(Dsh)使得Vang、Prickle募集至细胞膜处，通过 Jun、Daam、RhoA、Rac、细胞周期分裂基因(Cdc42)及微丝结合蛋白(Prolin)转导信号，控制细胞的极化和运动〔18〕。Wnt/Ca2+通路涉及细胞内钙的释放，这一途径中的Wnt蛋白包括Wnt5a，!Wnt11和Wnt4，它们与Fzd受体结合后，活化异源G蛋白，使膜上磷肌醇转化，将钙从贮存物中释放出来〔19〕，随着细胞内钙的增加，钙依赖信号分子比如钙调蛋白依赖蛋白激酶(CAMKⅡ)和蛋白激酶(PKC)〔19〕将会活化。非经典通路中的Wnt5a分子可抑制经典 Wnt途径的活化，这一作用是通过CAMKⅡ激活E3泛素连接酶复合物(Sian)，致使β-catenin的降解来完成的〔13〕。准确区分Wnt/Ca2+及Wnt/PCP通路比较困难，区分两者是通过辨别它们下游的效应分子，Jnk、Rac、Rho归属于PCP通路，而钙及PKC纳入Wnt/Ca2+范畴。

3.2 非经典Wnt信号通路在MSCs成骨分化中的作用 相比经典通路，非经典Wnt通路对MSCs分化作用的研究相对较少。据报道，磷酸化的RhoA和ROCK蛋白对MSCs成骨性分化具有重要作用〔20〕，受体蛋白Ror2的过表达，导致Runx2和Osterix上调，而Ror2反义RNA可抑制MSC成骨分化〔21〕。

Chang等〔22〕发现Wnt4可增加人类颅面组织分离的MSCs的成骨活性，但Wnt4并不增加细胞内β-catenin的水平，它激活另一新的非经典信号通路，即p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，骨形态发生蛋白(BMPs)和其他生长因子就是通过p38 MAPK通路诱导MSCs成骨分化。Axin的反义RNA将显著降低Wnt4诱导的p38活化，表明Wnt4信号通过Axin发挥作用，而p38抑制剂将阻断Wnt4激活的MSCs成骨分化。另外，使用不同的颅面骨损伤模型发现，表达Wnt4的MSCs将显著更新骨组织，促进颅面部修复。Arnsdorf等〔23〕研究发现，Wnt5a与MSCs谱系中成骨细胞的命运密切相关。RhoA酪氨酸激酶受体与Wnt5a结合后，激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，诱导Runx2和骨保护素的的表达，但骨钙素的水平不受影响，这表明Wnt5a可能在干细胞成骨分化的早期阶段发挥作用，但这一过程的完成还需其他因子的参与。

4 展望

Wnt经典途径对人MSCs成骨成脂的调节与细胞所处的微环境有关，Wnt4与Wnt5a均可激活成骨活化，但需要其他信号分子才能共同完成整个成骨分化过程。大面积骨损伤修复是一亟待解决的问题，而MSCs在再生医学、组织工程及骨形成等方面的临床应用也是鲜有报道。有研究表明，若给予MSCs联丁酰基-cAMP(PKA通路的激活剂)，就能使异位成骨从1.5%提高到6%〔24〕。Wnt信号通路的阐明，将揭示MSCs成骨机制，为骨质疏松治疗提供新思路。

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