小儿腹泻散微生物限度检查方法验证

2011-02-10马亮英蒋磊

中国现代药物应用 2011年20期

马亮英蒋磊

小儿腹泻散全方由儿茶、枯矾、半夏、朱砂、五倍子等药味组成，具有涩肠止泻之功效，用于小儿腹泻(水样便)的有效药物。现行收载的检查项下，没有规定具体的微生物限度检查方法，只采用常规方法进行微生物限度检查，其结果不能真实反映其污染的微生物状况［1］。为此笔者对小儿腹泻散按《中国药典》2010年版［2］进行了微生物限度方法学验证，有效提高了微生物污染检出率，从而保证检验结果准确性的检验方法，具体报告如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 HTY-2000A集菌仪(杭州泰林生物技术设备公司)。

1.2 菌种金黄色葡萄球菌【CMCC(B)26003】;枯草芽胞杆菌【CMCC(B)63501】;大肠埃希菌【CMCC(B)44102】;白色念珠菌【CMCC(F)98001;】;黑曲霉菌【CMCC(F)98003】

1.3 培养基改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、MUG培养基、胆盐乳酸增菌液、胆盐乳糖发酵培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基、麦康凯琼脂培养基，以上培养基均由北京三药科技开发公司生产

1.4 供试品小儿腹泻散由新疆医科大学第二附属医院药剂科提供

2 方法与结果

2.1 菌液及供试液制备取经(32.5±2.5)℃培养18～24 h，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌肉汤液体培养物1 ml加入9 ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5～10-7，为50～100cfu/ml，备用。另取经(25.5±2.5)℃培养18～24 h，白色念珠菌液体培养物1 ml加入9 ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5，备用。另取经25℃培养一周的黑曲霉菌斜面培养物，加入0.9%氯化钠溶液5 ml，洗下孢子，转移至另一空管中，用标准比浊管比浊，与浊度相当后，取1 ml加入9 ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10-4，为50～100cfu/ml，备用。

2.2 供试液制备取供试品制成浓度均为1∶10供试液后，用离心机(500r/min，3 min)离心，取上清液作为供试液。

2.3 回收率测定

2.3.1 细菌、霉菌和酵母菌用常规法预试验测定取供试液1 ml和已制备好的上述5种代表试验菌株1 ml分别注入平皿中。加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌的试验平皿倾注营养琼脂培养基，待凝固后，30～35℃培养3 d，计数;加入白色念珠菌、黑曲霉菌的试验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，23～28℃培养5 d，计数;每株试验菌平行制备2各平皿。结果该供试品对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌回收率＞70%，对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌的抑制作用较强。选择合适方法消除其在检验条件下对后两种菌的抑制作用，提高微生物的检出率。

2.3.2 用培养基稀释法测定取1∶10供试液1 ml等量分注5个平皿，1 ml试验菌同时加入平皿中，倾注营养琼脂培养基，30～35℃培养3 d，计数。结果回收率＜70%，说明采用培养基稀释法无法消除该供试品的抑菌活性，拟采用薄膜过滤法进行测定。

2.3.3 用薄膜过滤法测定取1∶10供试液10 ml，加入pH 7.0蛋白胨氯化钠缓冲液至100 ml，混匀，过滤。每只滤筒用pH 7.0蛋白胨氯化钠缓冲液100 ml，冲洗共3次，阳性对照在最后一次冲洗时分别加入1 ml试验菌，冲洗后取出滤膜，贴膜法测定，30～35℃培养3 d，计数。采用薄膜过滤贴膜法，冲洗量为每桶300 ml进行测定，结果回收率＞70%，说明采用薄膜过滤贴膜法可消除该供试品的抑菌活性。

2.4 控制菌检查方法的验证大肠埃希菌和大肠菌群可采用常规法进行检查;沙门菌可采用常规法进行检查。