严跃进，沈 勇，黄 伟，金燕敏，张莅峡

(海南亚洲制药有限公司药物研究所，浙江 金 华 321017)

淫羊藿为常用中药，为小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(Epimedium)多种植物的干燥地上部分。始载于《神农本草经》，别名仙灵脾。《本草纲目》中记载:茎叶入药，辛温无毒，具有“益精气，坚筋骨，补腰肾，强心力”等功效[1]。现代研究证明，淫羊藿苷、淫羊藿总黄酮、淫羊藿多糖是淫羊藿的主要有效成分。此外，尚还有生物碱、甾醇、卅一烷及维生素E等[2、3]，其主要有补肾壮阳、祛风湿、抑制微生物、扩张冠脉、抗衰老、促进骨细胞生长以及促进免疫等作用[4～6]。本文针对淫羊藿提取工艺研究中经常遇到的问题，采用不同浓度乙醇用冷渗漉法，考察了其提取工艺对淫羊藿苷、淫羊藿总黄酮及淫羊藿总多糖含量的比较研究。

提取淫羊藿中的主要成分——淫羊藿苷、总黄酮类及多糖等，通常采用的方法有乙醇热回流法、乙醇渗漉法、碱提取法、水提醇沉法等。但是由于在乙醇热回流法中，需要反复加热、多次回流，水提醇沉法中因为浓缩时间过长，这些都会使有效成分被破坏，无效杂质成分增多;在碱提取法中，提取和浓缩时，会发生苷类成分碱水解，使有效成分提取量减少。这些方法都有不足之处。所以我们采用乙醇冷渗漉的方法，选用不同浓度乙醇(20%、50%、70%和95%)，采用相同流速渗漉，以3个定量指标进行对比试验，以选取最佳乙醇提取浓度。这样可以使苷类成分损失较少，并且有效成分很少会被破坏，应当说这是最理想的提取方法

1 材料

SK3200H型超声处理器(120W，59HZ)(上海科导超声仪器有限公司);高效液相色谱仪(HPLC)HP-1100型(Agilwnt Technologies);色谱柱Kromasil C18(250×4.6mm 5mm serial:8511233);紫外分光光度计(岛津UV-2550);电子天平FA1004(上海精料天平公司);淫羊藿苷(中国药品生物制品鉴定所，批号0737-9709);D-无水葡萄糖(中国药品生物制品鉴定所，批号110833-200302);用于HPLC法测定的试剂均为色谱纯，水为重蒸馏水;用于分析的试剂均为分析纯，水为蒸馏水;淫羊藿(购于四川绵阳，经鉴定为箭叶淫羊藿)。

2 方法

2.1 冷浸-渗漉提取法

经过多次预试验并结合实际情况，我们设计了4个试验点:分别为20%、50%、70%和95%4个不同浓度乙醇提取液，作为选择以下相同实验条件，分段进行提取。

各称取500g经粉碎过筛的淫羊藿样品，用设计浓度的乙醇润湿2h，浸泡20h，并分别以上述浓度乙醇作为溶媒，按6.0ml/kg.mim的流速，渗漉至体积为3000ml(每取500ml渗漉液为1份，同浓度下按先后依次编号1#～6#)。分别减压浓缩直至干燥，得提取物称重(结果见表1及图1)，测淫羊藿苷(结果见表2及图2)及淫羊藿总黄酮(结果见表3及图3)。最后各用3000ml水渗漉，得水渗漉液，减压浓缩、干燥，得提取物、称重，测总多糖(结果见表4及图4)。

表1 4种乙醇浓度提取的提取物重量(g)

图1 4种浓度乙醇提取的提取物重量

2.2 生药的含量测定

2.2.1 方法 按照《中国药典》2005年版淫羊藿项下的检测方法[7]。

2.2.2 结果 测得淫羊藿苷的含量为0.69%，淫羊藿总黄酮含量是7.11%，表明药材符合《中国药典》规定。

2.3 醇提取中淫羊藿苷、淫羊藿总黄酮以及水提取中总多糖的测定

2.3.1 淫羊藿苷的含量测定(高效液相色谱法)色谱条件:色谱柱:Kromasil C18(250×4.6mm 5mm serial:8511233);流动相:乙腈-水(30∶70);流速:1.0ml/min;柱温:30℃;检测波长:UV270nm;进样量:10μl。

对照品溶液制备及标准曲线:精密称取淫羊藿苷对照品13.29mg，至25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取1ml～5ml至10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度摇匀。按上述色谱条件进样，以样品浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标。绘制标准曲线，得回归方程A=81212C－158.36，r=0.9991，表明淫羊藿苷浓度在0.05316－0.2658mg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。

淫羊藿苷测定用供试溶液的制备及测定:精密称取样品约0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20ml称定重量，超声处理1h再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀、滤过取续滤液即得。随后在上述条件下测定并计算得结果(详见表2及图2)。

表2 不同乙醇浓度从淫羊藿中提取淫羊藿苷的重量(g/500ml)

图2 不同乙醇浓度从淫羊藿中提取淫羊藿苷的重量(g/500ml)

2.3.2 淫羊藿总黄酮的含量测定(紫外分光光度法)紫外条件:岛津UV-2550型分光光度计，检测波长:UV270nm。

对照品溶液制备及标准曲线:精密称量取淫羊藿苷对照品13.29mg，至25ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。即得对照品溶液。精密量取对照品溶液0.3、0.5ml及1～6ml，分别至50ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度摇匀。以甲醇为空白，270nm波长处测定样品中淫羊藿总黄酮吸收度。以样品浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标。绘制标准曲线，得回归方程A=40.79379C－0.00135，r=0.9994，表明淫羊藿总黄酮浓度在0.0031896-0.063792mg/ml范围内与吸收度呈良好线性关系。

淫羊藿总黄酮测定用供试溶液的制备及测定:精密量取淫羊藿苷测定项下供试溶液0.5ml，置50ml容量瓶中，加甲醇至刻度摇匀，作为供试溶液。随后在上述条件下测定并计算结果(详见表3及图3)。

表3 4种不同乙醇浓度的提取物中总黄酮的重量(g/500ml)

2.3.3 总多糖的含量测定(DNS法)紫外条件:岛津UV-2550型分光光度计，检测波长UV520nm。

对照品溶液制备及标准曲线:精密称量在105℃干燥恒重的无水葡萄糖对照品约50mg，置于50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度摇匀，即得对照品溶液。经0.45μm滤膜过滤，弃取初滤液，取续滤液5ml，置于25ml容量瓶中，加水稀释至刻度摇匀。以水为空白，520nm波长处测定样品中淫羊藿总多糖吸收度。以样品浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标。绘制标准曲线，得回归方程A=5.67840C－0.22923，r=0.9992，表明淫羊藿总多糖浓度在0.04659-0.23296mg/ml范围内与吸收度呈良好线性关系。

图3 不同乙醇浓度从淫羊藿中提取淫羊藿总黄酮的重量(g/500ml)

还原糖供试品的制备:精密称取约35mg，置25ml容量瓶中，加水20ml超声处理，使完全溶解，定容至刻度，摇匀、滤过，取续滤液即得。

总多糖供试品的制备:精密称取约35mg，置50ml容量瓶中，加盐酸溶液(1－＞2)10ml，置沸水浴中10min取出，放冷后加40%氢氧化钠调PH至中性，加水至刻度摇匀、滤过，取续滤液即得。

表4 不同浓度乙醇处理后水提取物中总多糖含量(%)

总多糖的测定:精密量取上述对照品溶液，还原糖和总糖供试液各2ml。分别置10ml容量瓶中，各加入3，5-二硝基水杨酸试液1.5ml摇匀，置沸水浴中加热5min取出，立即放入冰水中冷却30min后，加水至刻度摇匀，在上述条件下测定并计算得结果(见表4及图4)。

图4 不同浓度乙醇处理后水提取物中总多糖含量

3 小结

针对不同的提取要求，采用不同的乙醇浓度。经过比较分析得出结论:提取淫羊藿苷为主时，宜选择用70%乙醇浓度提取;提取淫羊藿总黄酮为主，选择50%乙醇浓度为最佳;在相同得条件下，总多糖得提取则应该选择用70%浓度乙醇提取后，再用水渗漉得方法。

4 讨论

4.1 乙醇提取

图1显示:(1)20%和50%乙醇浓度提取时，当取渗漉液为3倍量时，达到最高值;(2)70%乙醇浓度提取时，渗漉液倍量呈线性降低趋势;(3)50%和95%乙醇浓度渗漉出的醇溶物重量分别为最高和最低。

4.2 从淫羊藿中提取淫羊藿苷

图2显示:(1)50%和70%乙醇提取时，随着渗漉液的不同，倍量呈线性降低趋势;(2)20%和95%的醇浓度提取时，淫羊藿苷的重量较低;(3)70%乙醇浓度提取时，淫羊藿苷的总重量达到最高值。

4.3 从乙醇中提取淫羊藿总黄酮

图3显示:(1)50%乙醇提取时，取3倍量时淫羊藿总黄酮达到最高值;(2)70%乙醇提取时，随着倍量的增加，总黄酮的重量呈线性速减;(3)20%和95%乙醇提取总黄酮时，总的重量较低;(4)用50%乙醇提取，总黄酮的总重量为最高。

4.4 水提物中提取总多糖

图4显示，70%浓度的乙醇提取时总多糖的损失较少，含量较高。95%乙醇提取后所得的水提物，黏性较大，得到总多糖的含量也较少。

[1]李时珍.本草纲目[M].第2册.北京:人民卫生出版社，1977.751.

[2]王昌林，李 昱，王粤新.淫羊藿及其有效成分的药理研究概况[J].中医中药杂志，1988，23(3):183.

[3]雷载权，陈松育，高学敏.中药学[M].上海:上海科学技术出版社，2001.288.

[4]阎爱荣，李爱军.淫羊藿的现代药理研究概述[J].传统中药研究，1999，2:62.

[5]蔡曼玲，季 晖，李 萍，等.5种淫羊藿黄酮类成分对体外成骨细胞的影响[J].中国天然药物，2004，4:235.

[6]蒋丽君，夏新华.抗痴呆胶囊水提取工艺研究[J].湖南中医学院学报，2000，20(2):26.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2010年版一部.北京:中国医药科技出版社，307.