王仕颖,孙崇崇,郑丹雯,王晓雯,陈文芳

(青岛大学基础医学院生理学与病理生理学系,山东 青岛 266071)

帕金森病(PD)是第二大常见的神经退行性疾病，主要病理表现为黑质致密部多巴胺(DA)能神经元的选择性死亡[1]。研究结果表明，α-突触核蛋白(α-synuclein)的过表达和错误折叠与PD的发展密切相关，它在病理状态下易聚集形成不溶性的纤维蛋白沉淀，导致神经元变性死亡[2]。淫羊藿是一种传统中草药，在中国被广泛用于治疗骨质疏松症、补肾壮阳、改善学习记忆功能等[3-5]。宝藿苷Ⅰ是淫羊藿的主要药理活性成分之一，多项研究已经证实宝藿苷Ⅰ具有丰富的药理作用，如抗肿瘤、抗骨质疏松等[6-7]。研究发现，宝藿苷Ⅰ可以通过抗氧化减轻大鼠的神经元损伤，还能够通过雌激素受体(ER)抑制破骨细胞的分化和骨的吸收[8-9]。但是宝藿苷Ⅰ对DA能神经元的损伤是否具有保护作用尚未见报道。本研究应用1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)损伤人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，探讨宝藿苷Ⅰ对MPP+诱导神经细胞损伤的保护作用及其可能机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用SH-SY5Y细胞购自中国科学院上海细胞库；宝藿苷Ⅰ购自上海同田生物技术有限公司，用二甲基亚砜(DMSO)配制成0.10 μmol/L溶液；MPP+购自Sigma公司，用磷酸盐缓冲液配制成浓度10 mmol/L的溶液；ER特异性阻断剂ICI 182,780购自Sigma公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Duchefa公司；DMEM高糖培养液和胎牛血清购自BI公司；青霉素/链霉素储存液购自北京索莱宝科技有限公司；PAGE凝胶快速制备试剂盒购自雅酶公司；兔抗α-synuclein抗体和兔抗β-actin抗体购自CST公司；山羊抗兔IgG-HRP二抗购自雅酶公司；ECL发光液购自Vazyme公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 SH-SY5Y细胞分别接种于96孔板和6孔板内，加入含体积分数0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM高糖培养液，在37 ℃、体积分数0.05 CO2条件下进行培养。

1.2.2MTT方法检测细胞活力 该实验分为对照组(A组)、MPP+组(B组)、MPP++0.01 μmol/L宝藿苷Ⅰ组(C组)、MPP++0.10 μmol/L宝藿苷Ⅰ组(D组)、MPP++1.00 μmol/L宝藿苷Ⅰ组(E组)、MPP++10.00 μmol/L宝藿苷Ⅰ组(F组)、MPP++20.00 μmol/L宝藿苷Ⅰ组(G组)。将SH-SY5Y细胞接种于96孔板，用不同浓度宝藿苷Ⅰ(前2组不用宝藿苷Ⅰ处理，后5组宝藿苷Ⅰ浓度分别为0.01、0.10、1.00、10.00、20.00 μmol/L)处理24 h，再加1 mmol/L 的MPP+(对照组除外)作用24 h，弃掉96孔板内的培养液，加5 g/L的MTT 20 μL，置37 ℃培养箱内孵育4 h；再将MTT轻轻吸出，每孔加入100 μL的DMSO溶解沉淀，室温避光摇床孵育10 min，待沉淀完全溶解后，用酶标仪读取光密度值，计算细胞存活率，根据细胞存活率筛选出宝藿苷Ⅰ的最佳用药浓度。

1.2.3免疫印迹法(Western blot)检测α-synuclein的表达 用6孔板培养细胞，该实验分为对照组、MPP+组、MPP++宝藿苷Ⅰ组、MPP++宝藿苷Ⅰ+ICI 182,780组、宝藿苷Ⅰ组。对照组和MPP+组的细胞分别给予体积分数0.001的DMSO和1 mmol/L 的MPP+处理；MPP++宝藿苷Ⅰ组细胞先应用0.10 μmol/L的宝藿苷Ⅰ预保护24 h，再给予1 mmol/L的MPP+作用24 h；MPP++宝藿苷Ⅰ+ICI 182,780组先应用1.00 μmol/L的ICI 182,780处理1 h，再给予宝藿苷Ⅰ和MPP+处理；宝藿苷Ⅰ组给予0.10 μmol/L宝藿苷Ⅰ作用48 h。药物处理细胞后，弃去细胞培养液，每孔加入裂解液(lysis∶PMSF=99∶1)100 μL，冰上裂解30 min后用细胞刮刮下蛋白，收集至1.5 mL的EP管中。在4 ℃下以12 000 r/min离心20 min，离心后取上清80 μL，使用BCA法测蛋白浓度。每组取15 μg蛋白上样并进行电泳，电泳完成后转膜，转膜条件为300 mA、90 min。应用50 g/L脱脂奶粉将膜封闭1 h，加入α-synuclein、β-actin一抗，4 ℃摇床孵育过夜，再加入HRP标记山羊抗兔IgG二抗孵育1 h，使用ECL发光液显影检测。应用Image J软件进行分析，目的蛋白的表达以α-synuclein与β-actin灰度值的比值表示。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 不同浓度宝藿苷Ⅰ对MPP+诱导的细胞存活率的影响

MTT检测结果显示，各组细胞存活率比较差异有显著性(F=51.070，P<0.01)。组间两两比较，应用MPP+处理后，SH-SY5Y细胞存活率明显下降(q=3.751，P<0.05)；0.10、1.00 μmol/L宝藿苷Ⅰ可有效对抗MPP+诱导SH-SY5Y细胞存活率下降(q=5.549、5.453，P<0.01)，且宝藿苷Ⅰ在0.10 μmol/L时效果最显著；而10.00和20.00 μmol/L的宝藿苷Ⅰ则会加重MPP+诱导的细胞损伤(q=6.408、13.650，P<0.01)。故选用0.10 μmol/L的宝藿苷Ⅰ进行后续实验。见表1。

2.2 宝藿苷Ⅰ对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞α-synuclein蛋白表达的影响

Western blot结果显示，各组细胞α-synuclein蛋白表达比较差异有显著性(F=7.913，P<0.01)。组间两两比较，与对照组相比，MPP+组SH-SY5Y细胞中α-synuclein蛋白表达水平明显增高(q=5.709，P<0.01)；而MPP++宝藿苷Ⅰ组细胞中α-synuclein蛋白表达水平较MPP+组明显降低(q=3.485，P<0.05)；ICI 182,780预处理可以阻断宝藿苷Ⅰ的神经保护作用(q=4.350，P<0.05)；宝藿苷Ⅰ单独应用对α-synuclein蛋白的表达无明显影响。见图1。

表1 不同浓度宝藿苷Ⅰ对MPP+诱导的细胞存活率的影响

①Western blot检测各组细胞中α-synuclein蛋白表达；②各组细胞α-synuclein蛋白表达水平的比较(n=4)。Control为对照组，MPP+为MPP+组，Bao+MPP+为MPP++宝藿苷Ⅰ组，Bao+MPP++ICI为MPP++宝藿苷Ⅰ+ ICI 182,780组，Bao为宝藿苷Ⅰ组。与对照组相比较，**q=5.709，P<0.01；与MPP+组相比较，∧q=3.485，P<0.05；与MPP++宝藿苷Ⅰ组相比较，#q=4.350，P<0.05。

3 讨 论

PD主要的病理改变为路易小体的堆积和黑质致密带DA能神经元的变性死亡，其机制与α-synuclein的聚集有关[2,10-12]。Parkin蛋白通过与神经突触素-1相互作用引起α-synuclein的泛素化，从而促进路易小体的形成[13]。研究表明，过度表达的α-synuclein可抑制囊泡内吞而影响神经传递过程，并且通过破坏DA的合成、储存、回收、再摄取和流出而导致PD[14]。

近年来，大量研究已证实传统中草药活性成分可以改善PD模型的病理进程[15]。本课题组前期的工作已证实，淫羊藿主要活性成分淫羊藿苷、淫羊藿素可通过ER途径发挥其对DA能神经元的保护作用。宝藿苷Ⅰ作为淫羊藿总黄酮的重要活性成分，具有多种药理作用。在鹅膏蕈氨酸诱导的脑功能障碍大鼠模型中，宝藿苷Ⅰ可以通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导对抗鹅膏蕈氨酸诱导的认知缺陷[16]。在过氧化氢(H2O2)诱导的高度分化的大鼠神经元PC12细胞模型中，宝藿苷Ⅰ通过减弱细胞内活性氧的产生、线粒体损伤和激活糖原合酶激酶-3β来抑制H2O2诱导的细胞死亡[17]。此外，在侧脑室注射脂多糖所致急性神经炎症的大鼠模型中，宝藿苷Ⅰ预处理不仅能抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，还可以通过抑制TOLL样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)/核因子κB(NF-κB)通路显著逆转多种炎症因子的表达[18]。为探讨宝藿苷Ⅰ对DA能神经元的保护作用及其机制，本研究利用MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤，观察宝藿苷Ⅰ是否能发挥神经保护作用。结果显示，0.10、1.00 μmol/L宝藿苷Ⅰ能明显对抗MPP+对SH-SY5Y细胞损伤，而10.00、20.00 μmol/L宝藿苷Ⅰ对SH-SY5Y细胞具有毒性作用；0.10 μmol/L宝藿苷Ⅰ预保护可以显著抑制MPP+诱导的α-synuclein表达上调。在本课题组前期的研究中，ER激动剂17β-雌二醇(E2)能够明显降低MPP+的毒性作用，但E2作为一种雌激素，长期使用可对人体产生严重的副作用。因此，从传统中药中寻找具有类雌激素样作用且副作用相对更小的植物雌激素，对中国传统中药的推广应用具有重要意义。已有研究表明，宝藿苷Ⅰ可以通过ER依赖性途径在刺激大鼠骨肉瘤UMR-106细胞增殖、碱性磷酸酶活性和NF-κB受体活化因子配体基因表达等方面发挥与雌激素相似的骨保护作用[19]。为进一步探讨宝藿苷Ⅰ神经保护作用是否与ER信号途径有关，本研究观察了ER特异性阻断剂ICI 182,780对宝藿苷Ⅰ神经保护作用的阻断效应，结果显示宝藿苷Ⅰ对α-synuclein蛋白表达的抑制作用可被ICI 182,780所阻断。以上结果表明，宝藿苷Ⅰ通过激活雌激素信号途径抑制MPP+诱导的α-synuclein蛋白表达上调，发挥保护DA能神经元的作用。

综上所述，宝藿苷Ⅰ能够抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤，其机制可能与ER信号途径有关。本文结果为研究宝藿苷Ⅰ神经保护作用的靶点和可能机制提供了新的实验依据。