王丽娟，张媛媛

（赤峰学院 医学院，内蒙古 赤峰 024000）

骨髓间充质干细胞的研究进展

王丽娟，张媛媛

（赤峰学院 医学院，内蒙古 赤峰 024000）

骨髓间充质干细胞主要存在于全身结缔组织和器官间质中,具有多种生物学特性及分离、培养的方法,在适宜的微环境里具有多向分化潜能.本文就骨髓间充质干细胞的分离、培养及其诱导分化的最新进展做一综述.

骨髓间充质干细胞；分离；培养；诱导分化

骨髓间充质干细胞是骨髓中除造血干细胞外的另一类具有高度可塑性的细胞群体,在特定的诱导条件下可以向中胚层细胞如成骨细胞、脂肪细胞和肌细胞；外胚层的神经细胞；内胚层的肝细胞分化,以满足基础研究和临床应用,同时具有易在体外培养、诱导和扩增等特性,被认为在基因治疗、细胞治疗、组织工程等领域具有广泛的临床应用前景.现就骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）的分离、培养及其诱导分化的最新进展做一综述.

1 骨髓间充质干细胞的生物学特性

1.1 骨髓间充质干细胞的形态特征

原代接种后约24h后就见有细胞贴壁，此时贴壁的细胞为单个,形态大部分为圆形，首次换液后5～7d可见由几十个到数百个细胞组成的集落,细胞形态呈梭形、三角形或星形.原代细胞培养10d左右,细胞快速增殖,每个集落中的细胞不断增殖呈“漩涡状”,培养2周左右,每个小集落形成约数百致上千个细胞的大集落,集落交界处出现重叠、融合.传代后的mmSCs增殖能力不断增加.

1.2 超微结构

透射电镜下骨髓间充质干细胞形态不一，多为圆形，可见核仁，核浆比例大，胞质内有分泌小泡，细胞器少，为低分化的幼稚细胞.

目前骨髓间充质干细胞并没有找到理想的特异性标志,它既有间质细胞的表面抗原,又有内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞的表面抗原,但不表达造血细胞的表面标志,如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、 CD8等,也不表达与人白细胞抗原(HLA)识别有关的共刺激分子B71、B72及主要组织相容性复合物Ⅱ类分子如HLA-DR抗原等，低表达：CD11b、CD54、CD106等，高表达：CD29、CD44、CD49e、CD105、CD13、CD48、CD71、CD56、CD90、CD166.在自然生长情况下,即使是1个细胞形成的克隆,其基因表达也呈多种细胞的表达特征.不同来源的骨髓间充质干细胞具有不同的生物学性质.标本来源、分离方法不同导致获得的细胞群不同,检测的细胞代次不同或培养基存在差异等种种因素,导致骨髓间充质干细胞获得或失去某些表面标记物表达的可能性不可排除.目前,Martinez等提出,正常骨髓中MSCs是惟一表达神经节苷脂-2(GD2)的细胞,因而GD2是第1个被报道的区分骨髓间充质干细胞和其他骨髓细胞的单一标志.这预示着GD2在对骨髓间充质干细胞的生物学研究和临床应用上将有重要价值.骨髓间充质干细胞必须具备的特征是:体外培养时呈成纤维样集落形成单位,并贴壁生长,以及能够自我更新、分化为3种以上间质细胞系.骨髓间充质干细胞周期研究表明,仅有10%MSCs处于S+G2+M期而绝大部分细胞停滞在G0+G1期.

2 骨髓间充质干细胞的分离方法

骨髓间充质干细胞最初的分离培养方法是由Friedenstein在70年代中期建立的.目前从体内分离骨髓间充质干细胞常用的方法有5种:全骨髓贴壁分离法、密度梯度离心法、红细胞裂解液分离法、特制培养板筛选法、流式细胞仪分离和免疫磁珠分离法.

2.1 贴壁分离法

全骨髓贴壁细胞分离法是根据骨髓中骨髓间充质干细胞贴壁生长,而造血系细胞悬浮生长的特性对二者进行分离,每次换液去除悬浮生长的造血细胞；传代时利用骨髓间充质干细胞较淋巴细胞、单核细胞易脱落的特点,保证骨髓间充质干细胞在短时间内与培养瓶底分开,而淋巴细胞、单核细胞因贴壁较强仍贴附于培养瓶底，从而使骨髓间充质干细胞得到进一步纯化.贴壁培养法具有操作简便、快速、细胞在离体后很少有分离所造成的损伤等优点,但由于骨髓中大量的造血干细胞与骨髓单个核细胞中含量极低的骨髓间充质干细胞一起培养，细胞的成分复杂，需经多次换液去除悬浮未贴壁细胞，影响骨髓间充质干细胞的贴壁及观察.

全骨髓贴壁分离法是将骨髓液注入等体积的Hanks液中，4℃1000r/min离心5min，弃上清，用Hanks液重复洗涤后培养.

2.2 密度梯度离心法

密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同,提取单个核细胞进行贴壁培养,单个核细胞包括干细胞、淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，一般认为,干细胞在形态上为淋巴细胞,其密度与淋巴细胞及单核细胞的密度基本相同,分离干细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳，常用的分层液有Ficoll和Percoll两种.

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2.2.1 Ficoll分离液法

Ficoll密度梯度分离法抽取Ficoll分离液（相对密度为1.077）5.0ml,将取得骨髓液轻轻铺于离心液上,2000r p m离心25min,此时离心管出现四个层面,小吸头轻轻吸取第二层乳白色单个核细胞层.

2.2.2 Percoll分离液法

Percoll密度梯度分离法是将相当于2倍骨髓液体积的1.073g/ml Percoll分离液加入15ml无菌离心管内，再将抗凝的骨髓沿管壁缓慢加至分离液面上，4℃800r/min离心30min，吸取分离液面上的白色云雾状单个核细胞层.

2.3 红细胞裂解液分离法

有人用红细胞裂解液溶解骨髓中的红细胞后获得单个核细胞.邓近平等进一步证实采用红细胞裂解液处理骨髓后再行接种，能提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率，同时不影响其贴壁后的生长，是一种可行的分离方法.

2.4 特制培养板筛选法

利用MSCs的形态大小及贴壁时间的特性,设计一特殊的培养皿进行培养筛选,培养皿内套有直径为3μm小孔的板,培养5～7d时在孔板上面贴壁的细胞即为MSCs,纯度可达90%以上.

2.5 免疫磁珠或流式细胞仪分离法

通过MSCs表面带有或缺失的抗原成分进行正选或负选,从而获得相对纯化的MSCs.单克隆抗体磁珠分离系统或流式细胞仪技术对细胞活性影响较大,而且实验条件要求高,需要骨髓量大,从一个部位每次抽取的骨髓的量不应超过2ml,否则将因吸出物中血量的增加引起有核细胞明显减少.

3 骨髓间充质干细胞的培养

骨髓间充质干细胞对营养条件要求高，而且含量很低，约为0.001%～0.01%，要利用骨髓间充质干细胞就必需实现其体外分离培养及扩增.王忠琼等用含10%胎牛血清的DMEM-L G培养BM-MSCs，3d后首次换液,以后每2～3d换液1次,待细胞生长至瓶底80%～90%融合时,按1：2～3比例传代培养.马力等将分离的骨髓间充质干细胞浓度调整为1×106，分别加Mesencult干细胞培养基、DMEM/F 12培养基、L-DMEM培养基，各组培养基中均含有20%的胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素，置于C O2饱和湿度培养箱中培养,发现应用3种不同培养液培养兔骨髓间充质干细胞，结果显示各组细胞均生长状态良好，在细胞活性、增殖速度、贴壁率、均质性方面Mesencult培养液略优于DMEM/F 12、L G-DMEM培养液，但差异无著性意义.周新伏等分别用含10%脐带血清、胎牛血清(F C S)、成人血清的DMEM/F 12培养基和Mesencult培养基培养，发现脐带血清与Mesencult组培养的BM-MSCs的纯度和体外诱导分化能力,优于F C S和A B型血清组,脐带血清适合临床应用.总之，不同培养基、不同质和量的血清、不同的种植密度、首次换液时间、都会影响MSCs的生长.大多数的学者都采用低糖DMEM培养BM-MSCs.

4 骨髓间充质干细胞的分化

BM-MSCs的多向分化潜能被认为是其最重要的生物学特征.研究表明,在不同的诱导条件下BM-MSCs能够向不同的谱系分化，不仅可分化为间质组织如成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和肌肉细胞等，而且可以跨胚层分化.

4.1 骨髓间充质干细胞向脂肪细胞的分化

刘厂辉等[12]发现氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR γ）基因在MSC向脂肪细胞分化的早期中起重要的正向调节作用,并促进脂肪分化相关蛋白(ADRP)基因和蛋白的表达，PPAR γ基因过表达可增强MSC向脂肪细胞分化的能力,缩短分化进程,提高分化效率,可能与增强ADRP的表达有关.徐道华等利用内含3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛、地塞米松、不同浓度的胰岛素及胎牛血清的DMEM定向诱导BM-MSCs，发现10mg/L胰岛素、0.1mm o l/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.1mm o l/L吲哚美辛、0.1um o l/L地塞米松、体积分数为0.1胎牛血清的DMEM分化诱导液定向诱导可获得较好的成脂分化效果.徐无忌等不但用成脂诱导液将BM-MSCs成功诱导成脂肪细胞，而且还发现中药骨康含药血清可抑制成脂诱导剂对BM-MSCs向脂肪细胞分化的促进作用.

4.2 骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

BM-MSCs在体内可被诱导分化为神经细胞.苏平等用银杏内酯B诱导的BM-MSCs，用膜片钳全细胞记录方式检测细胞内外的离子通道电流，发现银杏内酯B诱导的MSCs,不仅具有神经细胞的外形和免疫学特征,而且具有神经元的基本电生理功能.袁维等的实验结果表明增强型绿色荧光蛋白基因能成功的转染BM-MSCs并有效表达，转染后增强型绿色荧光蛋白-骨髓间充质干细胞能常规培养，持续3个月仍能稳定地表达绿色荧光.转染后BM-MSCs在DMSO、BHA等试剂定向诱导后，获得的神经细胞存活时间较长，观察至第7天仍有10%神经元样细胞存活.诱导5h后部分增强型绿色荧光蛋白转染的骨髓间充质干细胞便可转变为神经元样细胞，并有轴突和树突出现；诱导24h后绝大多数骨髓间充质干细胞都可分化为神经元，且多个神经元之间可形成网络，说明转染后的BM-MSCs的生物学性状没有发生改变.有的学者用丹参注射液在体外将大鼠BM-MSCs诱导分化为神经元样细胞.也有报道分别用鼠脑C6胶质瘤细胞上清液和大脑皮层细胞条件培养液促进BM-MSCs向神经样细胞分化.

4.3 骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

徐洪军等将成年大鼠BM-MSCs在20μg/L肝细胞生长因子的诱导下，甲胎蛋白细胞免疫组织化学染色培养第7天即出现阳性，第14天清蛋白和细胞角蛋白18免疫组织化学染色阳性，分化为肝细胞.胡晶等用成纤维生长因子-2(FGF-2)在体外定向诱导大鼠BM-MSCs，发现诱导后BM-MSCs由棱形向多角形、卵圆形方向变化，白蛋白、CK19和糖原12d即有阳性表达,以后随诱导时间的延长阳性率逐渐升离.20n g/mlFGF-2诱导比10n g/mlFGF-2诱导细胞白蛋白、CK19和糖原的表达量均多.20n g/mlFGF-2具有较强的诱导BM-MSCs向肝细胞样细地分化的能力.目前，体外诱导BM-MSCs向肝细胞分化主要使用以下诱导因子：肝细胞生长因子、FGF、表皮生长因子等.但是,体外诱导BM-MSCs分化为肝细胞的关键因素是什么？哪一种因子诱导细胞转化效率更高这些都尚未完全明了.

5 存在的问题及展望

近年来关于骨髓间充质干细胞的研究有了较大发展，但将骨髓间充质干细胞应用于临床，仍面临许多问题:（1）不同个体之间存在着生物学差异,各个实验室条件参差不齐,分离纯化细胞群的技术有待进一步提高;（2）从已有报道来看，尚没有哪种方法能在体外将BM-MSCs全部诱导分化为所需的功能细胞，如何提高诱导BM-MSCs向功能细胞分化的分化率尚需进一步探讨;（3）骨髓间充质干细胞实验仅限于自体移植方面，在异体移植免疫反应问题上有待进一步探索.

随着三维细胞培养移植模型的进一步发展、基因转染技术的完善和生物可降解材料的日趋成熟，骨髓间充质干细胞移植将有更广阔的前景，骨缺损、骨不连的治疗将进入一个工程化修复重建的崭新领域.

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1673-260X（2010）03-0070-03