迟 源，王 好*，钱爱东

(1.吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春130118；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118)

羊传染性脓疱病(Contagious ecthyma)是由羊传染性脓疱病毒(Orf virus)引起的一种人畜共患、接触性、嗜上皮性传染病，俗称羊口疮(Orf)。近些年来该病呈现重新流行的趋势，世界各地都相继报道了该病的流行[1-3]。范春玲等报道了我国2006年北京市亚福动物养殖中心暴发该病，传播速度快，发病率高达95.4%[4]。Orf病毒的开放阅读框ORF059基因即F1L基因，与痘苗病毒的H3L基因具有一定的同源性[5]，其编码的39 ku蛋白是囊膜蛋白[6]，与病毒吸附和穿入宿主细胞有关，是刺激宿主免疫应答的主要抗原之一[7]，ORF027基因表达病毒核蛋白。因此，本实验对采自吉林省榆树市的疑似本病的羊痂皮病料进行了病毒分离鉴定，并对该分离株的ORF027基因、ORF059部分基因进行克隆、序列分析以及构建系统进化树，旨在为研究本病的流行规律和新型疫苗研制奠定其生物学基础。

1 材料和方法

1.1 病料来源 吉林省榆树市2007年自然感染、临床疑似Orf的病羊，无菌采集其口唇部痂块组织。

1.2 主要试剂 ExTaqDNA聚合酶、E.coliDH5α及pMD18-T载体均购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司。

1.3 病毒分离

1.3.1 病料处理 无菌采集的痂块称重、研磨，按1∶5(W/V)比例加入 PBS制成悬液，加入双抗2000IU/mL，置4℃过夜，离心取上清液，-20℃保存。

1.3.2 病毒的分离培养 无菌摘取新生健康犊牛睾丸，以0.25%胰蛋白酶37℃消化制备单个细胞，37℃、5%CO2培养。挑选生长致密单层细胞消化制成悬液，加入处理的病毒液0.5 mL及5%血清浓度的MEM营养液，37℃培养，另设空白细胞作对照，当出现75%的细胞病变(CPE)时收毒。……