张莉莉，白 娟，王先炜，李玉峰，王兴龙，姜 平

(南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京210095)

近来研究表明，机体针对病毒及其他病原生物等病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的入侵所产生的先天性免疫及特异性免疫由模式识别受体启动。Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)是1997年发现的一类重要的模式识别受体[1]，迄今共发现11种人的TLR和13种小鼠TLR[2]。每种TLR家族能识别特异的微生物病原体PAMP，并触发激活特殊的信号途径，导致炎性和抗炎性细胞因子基因的转录翻译[3]。其中，TLR3、7、8都属于识别核酸的TLR家族成员，TLR3识别病毒来源的双链RNA及人工合成的双链RNA-Poly-IC[4]，TLR7、8具有很高的相似程度，它们均参与单链RNA病毒的识别[5]。巨噬细胞(AM)、中性粒细胞、树突状细胞(DC)等多种免疫细胞均可高水平表达多种TLR[6]。因此，研究猪TLR3、7、8基因的结构和功能对于揭示猪传染病的发生和传播机制及天然免疫的调节机理具有重要的意义。

目前，国外对于猪TLR3、7、8分子的研究已取得一定进展，Liu等发现用猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)感染猪后，TLR2、3、4、7、8的表达量在至少一种淋巴细胞或组织中有上调[7]，Poly IC刺激后能下调AM和DC的TLR7和TLR8的表达。而国内对猪TLR3、7、8的研究尚未见报导。本实验从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中克隆猪TLR3、7、8基因，并用生物信息学方法进行分析，旨在为深入研究猪TLR3、7、8的分子功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 样品及主要试剂 DH5α由本实验室保存；PAM由PRRSV阴性猪肺脏分离；Trizol试剂购自Invitrogen公司；M-MLV反转录酶购自Promega公司；Taq酶购自Tiangen公司；限制性内切酶、T4连接酶、pMD18-T载体购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 PAM的分离与培养 选4周龄～6周龄健康仔猪，无菌摘取猪肺脏，用含0.2%的EDTA的PBS灌洗肺脏。灌洗液经8层纱布过滤后1500 r/min离心15 min，用0.01 M PBS(pH7.0)洗涤2次，最后用含10%新生牛犊血清的RPMI-1640营养液重悬，经0.2%台盼兰检测细胞活性达90%以上，调整细胞浓度为5×105/mL，铺于细胞板，37℃培养4 h～6 h后弃去未贴壁细胞，37℃5%CO2培养。

1.3 RNA提取 取出六孔板中PAM细胞培养物，采用TRIzol试剂裂解法提取细胞总RNA，-20℃保存备用。

1.4 引物设计及RT-PCR扩增 根据GenBank中登录的TLR3、7、8的序列，应用软件Primer 5.0进行引物设计，由Invitrogen公司合成(表1)。以Oligo dT和不同基因的下游引物进行反转录，获得cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：94℃3 min；94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 2 min，35个循环；72℃10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.5 目的基因克隆和测序 PCR产物回收纯化，按常规方法与pMD18-T载体进行连接，转化至DH5α感受态中，涂布平板，37℃过夜培养菌体。挑取单个菌落，于LB培养过夜，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定出阳性克隆，由上海英骏公司进行测序。

表1 RT-PCR引物Table 1 Primers used in RT-PCR

1.6 序列分析及结构预测 将基因测序结果与GenBank中登录的相关序列进行BLAST比较，用DNAStar软件分析其遗传演化关系，运用TMHMM Server v2.0软件分析其跨膜区。

2 结果与讨论

2.1 TLR不同基因片段RT-PCR扩增结果 PCR扩增得到TLR3、7、8的8条基因片段，与预期的大小结果相符(图1)。由于TLR3、7、8基因较长，采用RT-PCR一次扩增获取全长基因难度较大，所以本研究采用分片段扩增方法，获得较好效果。本实验中，分别用Oligo dT和下游引物进行反转录，结果显示下游引物反转录的效果更好。

2.2 TLR基因克隆与酶切鉴定 将TLR基因不同片段重组质粒pMD-TLR3、pMD-TLR7和pMD-TLR8，进行双酶切鉴定。得到的外源片段的大小与PCR扩增得到的相对应的TLR的基因大小一致，证明目的基因已成功克隆至T载体中。

2.3 TLR基因测序结果 将不同基因的分片段扩增的结果拼接，获得猪TLR3、7、8全基因序列，并已录入 GenBank，序列号分别为 GU013759、GU013760和GU013761。其中，pTLR3、7、8基因开放阅读框(ORF)分别为2718 bp，3153 bp，3087 bp，分别编码906个、1051个、1029个氨基酸。

2.4 TLR基因遗传演化分析 将克隆猪TLR3、7、8的序列用DNAStar软件分别与猪、人、鼠、牛、羊、马、鸡相应基因序列进行同源性分析。结果显示，TLR3基因序列与其他猪的序列同源性达99.3%～99.8%，与牛、马、人、鼠的同源性分别为88.6%、89.4%、86.0%和80.1%(图2A)。TLR7基因序列与其他猪的同源性达98.9%～99.8%，不同种之间与牛的同源性较高达90.1%，与羊、人、鼠的同源性分别为89.1%、87.3%、80.7%，与鸡的同源性最低仅为66.6%(图2B)。TLR8基因序列与其他猪的同源性达99.3%～99.5%，与牛、羊、人、鼠的同源性分别为84.2%、83.3%、79.8%、74.3%(图2C)。其基因系统发生树分析结果表明，各种动物TLR基因系统发生关系上与物种之间的亲缘关系密切。

2.5 猪TLR3、7、8基因推导的氨基酸序列同源性分析 猪TLR3基因，种内比较同源性很高，仅在aa 87、aa 281、aa 369、aa 419和aa 701共5处存在突变，与牛、羊、马、人、鼠相比差异较大，共有保守区为 aa 36～aa 44、aa 53～aa 63、aa 153～aa 167、aa 170～aa 179、aa 511～aa 523、aa 645～aa 655、aa 727～aa 741、aa 830～aa 850、aa 856～aa 874、aa 876～aa 887，末端同源性较高。

不同猪的TLR7基因氨基酸序列非常保守，在aa 79、aa 389和aa 963有3处突变，与牛、羊、鸡、人、鼠相比，保守区在aa 41～aa 88、aa 80～aa 89、aa 164～aa 173、aa 189～aa 201、aa 266～aa 278、aa 307～aa 315、aa 940、aa 954、aa 957～aa 968。

猪TLR8基因氨基酸序列，种内在aa 609、aa 780、aa 850、aa 867、aa 870、aa 892、aa 918、aa 928和aa 935存在9处突变，与牛、羊、人、鼠相比保守区在 aa 130～aa 139、aa 252～aa 261、aa 292～aa 301、aa 614、aa 623、aa 877～aa 885、aa 946～aa 954、aa 956～aa 970、aa 989～aa 1006，末端同源性较高。

2.6 跨膜区预测 运用TMHMM Server v2.0软件分析发现，猪TLR3基因编码的分子可能由胞外区(aa 1～aa 703)、跨膜区(aa 704～aa 726)和胞内区(aa 727～aa 905)3部分组成。

猪TLR7、8基因编码分子可能的胞外区、跨膜区和胞内区分别位于aa 1～aa 843和aa 1～aa 814、aa 844～aa 866和 aa 815～aa 837以及 aa 867～aa 1050和 aa 838～aa 1028。因此，猪 TLR3、TLR7、TLR8蛋白均是跨膜蛋白，这与目前已知的TLR家族所共有的结构相一致。

TLR在病毒感染和宿主免疫中的作用已受到人们的广泛关注。TLR分子和功能的鉴定，不仅使人们对天然免疫系统地认识达到一个新的水平，而且也为传染性疾病的治疗提供了新的思路，如Nicol等的研究表明HIV可以通过对Toll样受体免疫应答途径的抑制来降低TNF-α的合成量，从而抑制机体的免疫应答反应[9]。TLR3对流感病毒引起的肺炎具有一定的抑制作用[10]。目前，人和鼠的TLR研究取得了较大的进展，但有关猪、牛和家禽等动物TLR分子结构与功能的研究甚少，特别是在宿主动物识别病原模式、病原与宿主相互作用的机制研究等方面尚未引起广泛关注。本研究从分离的猪肺泡巨噬细胞中，克隆了猪TLR3、7、8基因，为其结构与功能的研究奠定了基础。

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