赵 钦，周恩民，孙培明，董施伟，张 璐，孙亚妮，姜世金1,2,

(1.山东农业大学动物医学院“泰山学者”免疫生物学实验室，山东泰安271018；2.山东省动物生物技术与疫病防控重点实验室，山东泰安271018；3.山东农业大学动物医学院预防兽医系，山东泰安271018)

禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)属于肝炎病毒属，为无囊膜、单股正链RNA病毒。禽HEV由Ritchie等经患有肝脾肿大综合征(Hepatitissplenomegaly syndrome，HSS)的病鸡组织中分离得到[1]，通过血清学和分子流行病学调查，证实了禽HEV为HSS主要病原[3-5]。我国部分地区流行病学调查表明：鸡群中禽HEV的血清抗体阳性率达到30%左右[6-7]。禽HEV基因组全长约6.6 nt，包含3个开放阅读框(ORF)，分别为 ORF1、ORF2和ORF3。已有研究报道采用RT-套式PCR方法对禽HEV进行检测[2-4,7]，其中Sun等设计的针对ORF2基因保守序列的引物得到了广泛应用[7]，Bilic等利用该引物对欧洲部分国家和澳大利亚的禽HEV感染状况进行了检测，发现以该引物扩增的序列构建的进化树与以全基因组序列构建的进化树一致[4]。本实验从山东省某鸡场收集粪便和肝脾肿大鸡的胆汁，利用Sun设计的引物[7]进行禽HEV ORF2基因的检测，并对获得的部分禽HEV ORF2基因片段与其它国家的参考序列进行比较分析。

1 材料和方法

1.1 样品来源 10份鸡粪便和8份胆汁样品采自山东省某肉种鸡场HSS病鸡。粪便进行预处理，-80℃保存备用。

1.2 引 物 参照文献[7]方法，合成扩增ORF2部分序列的套式PCR引物，外侧引物序列为ORF2/F-1/SD：5'-TCGCCT(C)GGTAAT(C)ACA(T)AAT GC-3'，ORF2/R-1/SD：5'-GCGTTC(G)CCG(C)AC AGGT(C)CGGCC-3'；内侧引物序列为ORF2/F-2/SD：5'-ACA(T)AATGCT(C)AGGGTCACCCG-3'，ORF2/R-2/SD：5'-ATGTACTGA(G)CCA(G)CTG(C)GCCGC-3'，由上海生工生物技术服务有限公司合成，目的片段分别为278 bp和242 bp。

1.3 粪便和胆汁样品中禽HEV RNA的检测 参照文献[7]的RT-PCR程序，用TRIzol试剂(Invitrogen)从140 μL 10%粪便上清和胆汁中提取总RNA，反转录制备cDNA。以cDNA为模板，采用引物ORF2/F-1/SD和ORF2/R-1/SD进行ORF2部分基因的第一次PCR扩增，反应条件为：95℃10 min；95℃45 s、48℃ 45 s、72℃ 45 s，39个循环；72℃10 min。以该产物为模板，采用引物ORF2/F-2/SD和ORF2/R-2/SD进行第二次扩增，反应条件中退火温度为54℃，35个循环，其余条件同第一次PCR。PCR产物琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.4 PCR产物的克隆与序列分析 琼脂糖凝胶纯化与回收PCR产物，连接pMD18-T载体，阳性重组质粒由南京金思瑞生物科技公司进行测序。将获得的序列采用生物学软件与NCBI上登录的序列(EU919193～EU919196、 FM872311～FM872320和AY870812～AY870831)进行同源性和进化树分析。

2 结果与讨论

2.1 样品检测结果 10份鸡粪便样品中，7份样品能用禽HEV ORF2引物扩增出大小约为250 bp的目的片段；8份鸡胆汁样品中，6份扩增出目的片段(图1)。证明已利用该引物检测到禽HEV RNA，从病毒的核酸水平证实禽HEV感染的存在。这是我国首次报道禽HEV核酸检测阳性。

2.2 禽HEV部分ORF2基因序列的测定与分析获得的13份阳性样品序列均为242 bp禽HEV ORF2基因的部分片段。挑选其中的4个序列录入GenBank，序列号 分 别 为 GQ398039、GQ398040、GQ398041和GQ398042，分别命名为China 09-Z56，China 09-A5，China 09-B3和China 09-G57。13个序列的同源性在97.1%～98.3%之间，具有很高的同源性，这可能是样品来自同一鸡场的原因；与其它国家的禽HEV参考序列同源性为77.3%～95.5%，其中与欧洲的病毒株同源性最高，为95.5%～97.6%，可能是由于本实验所用种鸡是由欧洲某种鸡场引进的有关；而与美国的和西班牙来源的禽HEV的序列之间同源性较低，为77.3%～77.9%。同时，本实验获得的序列与其它国家的禽HEV参考序列构建的进化树显示，与欧洲的在同一分支上，同属禽HEV基因3型(图2)，证实了Bilic等指出的禽HEV基因分型的地域性特点[4]，但其与致病性的关系则有待进一步的实验研究。

[1]Ritchie S J,Riddell C.'Hepatitis-splenomegaly'syndrome in commercial egg laying hens[J].Can Vet J,1991,32:500-501.

[2]Huang F F,Haqshenas G,Shivaprasad H L,et al.Heterogeneity and seroprevalence of a newly identified avian hepatitis E virus from chickens in the United States[J].J Clin Microbiol,2002,40(11):4197-4202.

[3]Peralta B,Biarne'sM,Ordo'nez G,etal.Evidence of widespread infection of avian hepatitis E virus(avian HEV)in chickens from Spain[J].Vet Microbiol,2009,137:31-36.

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[5]梁久红，孟继鸿.人、猪、禽戊型肝炎病毒血清学关系的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2007，27：581-586.

[6]张璐，周恩民，崔治中，等.禽戊型肝炎血清学调查以及与肝脾肿大综合征关系的研究[J].中国家禽，2008，30(20)：22-25.

[7]Sun Z F,Larsen C T,Dunlop A,et al.Genetic identification of avian hepatitis E virus(HEV)from healthy chicken flocks and characterization of the capsid gene of 14 avian HEV isolates from chickens with hepatitis-splenomegaly syndrome in different geographical regions of the United States[J].J Gen Virol,2004,85:693-700.