赵 钦，周恩民，孙培明，董施伟，张 璐，孙亚妮，姜世金1,2,

(1.山东农业大学动物医学院“泰山学者”免疫生物学实验室，山东泰安271018；2.山东省动物生物技术与疫病防控重点实验室，山东泰安271018；3.山东农业大学动物医学院预防兽医系，山东泰安271018)

禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)属于肝炎病毒属，为无囊膜、单股正链RNA病毒。禽HEV由Ritchie等经患有肝脾肿大综合征(Hepatitissplenomegaly syndrome，HSS)的病鸡组织中分离得到[1]，通过血清学和分子流行病学调查，证实了禽HEV为HSS主要病原[3-5]。我国部分地区流行病学调查表明：鸡群中禽HEV的血清抗体阳性率达到30%左右[6-7]。禽HEV基因组全长约6.6 nt，包含3个开放阅读框(ORF)，分别为 ORF1、ORF2和ORF3。已有研究报道采用RT-套式PCR方法对禽HEV进行检测[2-4,7]，其中Sun等设计的针对ORF2基因保守序列的引物得到了广泛应用[7]，Bilic等利用该引物对欧洲部分国家和澳大利亚的禽HEV感染状况进行了检测，发现以该引物扩增的序列构建的进化树与以全基因组序列构建的进化树一致[4]。本实验从山东省某鸡场收集粪便和肝脾肿大鸡的胆汁，利用Sun设计的引物[7]进行禽HEV ORF2基因的检测，并对获得的部分禽HEV ORF2基因片段与其它国家的参考序列进行比较分析。

1 材料和方法

1.1 样品来源 10份鸡粪便和8份胆汁样品采自山东省某肉种鸡场HSS病鸡。粪便进行预处理，-80℃保存备用。

1.2 引 物 参照文献[7]方法，合成扩增ORF2部分序列的套式PCR引物，外侧引物序列为ORF2/F-1/SD：5'-TCGCCT(C)GGTAAT(C)ACA(T)AAT GC-3'，ORF2/R-1/SD：5'-GCGTTC(G)CCG(C)AC AGGT(C)CGGCC-3'；内侧引物序列为ORF2/F-2/SD：5'-ACA(T)AATGCT(C)AGGGTCACCCG-3'，ORF2/R-2/SD：5'-ATGTACTGA(G)CCA(G)CTG(C)GCCGC-3'，由上海生工生物技术服务有限公司合成，目的片段分别为278 bp和242 bp。

1.3 粪便和胆汁样品中禽HEV RNA的检测 参照文献[7]的RT-PCR程序，用TRIzol试剂(Invitrogen)从140 μL 10%粪便上清和胆汁中提取总RNA，反转录制备cDNA。……