刘庆堂，职爱民，李青梅，柴书军，赵 东，张 磊，邓瑞广，张改平

(河南省农业科学院农业部动物免疫学重点开放实验室，河南郑州450002)

诺氟沙星(Norfloxacin，NFLX)是第3代氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones，FQNS)重要的一种，具有广谱抗菌作用，主要用于治疗畜禽细菌性疾病和支原体感染，尤其对需氧革兰阴性杆菌的抗菌活性高，而且在体外对多重耐药菌亦具抗菌活性，因此被广泛大量地添加到饲料中，应用于畜禽疾病的治疗和预防。然而，NFLX进入畜禽机体后，在动物体内消除缓慢，半衰期长，形成严重的残留，造成对动物源性食品安全和人类食源性疾病的发生[1-2]，鉴于FQNS的毒副作用，世界各国都对其使用范围和使用对象做出了限定，我国规定其最大残留限量为50μg/L[3]。目前检测NFLX残留的方法多是高效液相质谱(HPLC)和液质联用(HPLC-MS)[4-10]等理化方法，虽然可以精确测定，但存在需要昂贵仪器，样品前处理复杂、繁琐费时、不能现场操作等缺陷，限制了其应用。免疫学分析方法具有灵敏、快速、特异、简便等优点，近年来在兽药、农药残留检测领域已被广泛应用[11-14]。本研究应用NFLX人工抗原免疫BALB/c小鼠，建立分泌抗NFLX MAb的杂交瘤细胞株，为免疫学检测方法的建立和拥有自主知识产权检测产品的开发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试剂与溶液 盐酸诺氟沙星为中国兽医药品监察所产品；BSA和OVA为Pierce产品；完全佐剂(Freund's complete adjuvant,FCA)、不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant,FIA)、细胞培养基RPMI-1640、选择培养基HAT、HT和PEG-1500为GIBCO产品；新生牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)为Sigma产品；羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)为华美生物工程有限公司产品；其它试剂均为AR级。NFLX标准液，0.01 mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)为稀释液，根据需要配制；洗液(PBST)为PBS含0.05%Tween-20；包被液(CBS)为0.1 mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液；间接ELISA和阻断ELISA的封闭液、稀释液为含5%猪血清的PBST；显色液为TMB的醋酸-柠檬酸缓冲液；终止液为2 mol/L的硫酸溶液。

1.2 实验动物和细胞 6周龄SPF级BALB/c小鼠购自郑州大学医学院实验动物中心；小鼠骨髓瘤细胞株NS0由英国国家动物健康研究院惠赠。

1.3 人工抗原的合成与鉴定

1.3.1 人工抗原的合成 采用碳二亚胺法合成BSA-NFLX完全抗原。同法制得包被抗原OVA-NFLX。

1.3.2 人工抗原的鉴定

1.3.2.1 UV鉴定 用PBS配制NFLX和BSA标准溶液，取一定量的BSA-NFLX溶于PBS，测定其蛋白质的浓度，据此浓度调节BSA-NFLX溶液中BSA的浓度与BSA标准溶液一致，在波长200 nm～400 nm范围内进行紫外扫描，根据扫描结果判定偶联效果。

1.3.2.2 SDS-PAGE鉴定 参照文献报道[15]方法进行试验，浓缩胶为5%(W/V)，分离胶为10%(W/V)，浓缩电压为70 V，分离电压为85 V，上样量为20 μL，考马斯亮蓝染色5 h～6 h后，置脱色液中脱色过夜。

1.4 小鼠多抗血清(pAb)效价测定

1.4.1 小鼠免疫 用 0.22 μm滤膜无菌过滤的BSA-NFLX免疫6周龄雌性BALB/c小鼠3只，免疫剂量为50 μg 200 μL/只，背部皮下分4～6点注射。首免用无菌PBS溶解BSA-NFLX与等量FCA混合，充分乳化；加强免疫将PBS溶解的BSANFLX与等量FIA混合，首免后2周进行，共免疫4次，每次间隔2周，最后1次免疫后12 d断尾采血分离血清。用间接ELISA检测抗NFLX抗体效价，若效价>1.6×10-3即可用于细胞融合；超强免疫用无菌PBS溶解BSA-NFLX，最后1次加强免疫后4周，细胞融合前4 d，腹腔注射BSA-NFLX 50 μg 200 μL/只。

1.4.2 小鼠抗血清效价和敏感性测定

1.4.2.1 间接ELISA测定pAb的效价 基本程序参照Tijssen[16]的方法，具体如下：OVA-NFLX 1 μg/mL包被酶标板并封闭，加入待检血清，室温孵育20 min，PBST洗涤3次；每个样品孔中加入1∶1000稀释的GaMIgG-HRP 50 μL，室温孵育20 min，PBST洗板6次；每孔加入底物缓冲液A、底物缓冲液B混合液50 μL，室温显色反应10 min，加入终止液50 μL终止反应；用酶标仪读取各孔OD450nm值。

1.4.2.2 阻断ELISA测定抗体敏感性 OVA-NFLX 1 μg/mL包被酶标板并封闭，加入不同浓度的NFLX等标准液和工作浓度的待检抗血清，设阴性和空白对照，室温孵育20 min，PBST洗板3次，加入GaMIgG-HRP，室温孵育20 min，PBST洗板6次，显色10min，终止并读取OD450nm值，计算IC50值。

1.5 杂交瘤细胞株的建立

1.5.1 融合备用鼠选择 用阻断ELISA筛选抑制价最低的小鼠作为融合备用小鼠。

1.5.2 细胞融合 用1640完全培养液培养NS0骨髓瘤细胞，于融合前2 d传代培养；融合前1 d取昆明鼠一只，腹腔注入冷的HAT培养基6 mL～8 mL，轻轻揉动后抽出腹腔巨噬细胞并以50 μL/孔铺于96细胞培养板中，作为饲养细胞，小鼠超强免疫后4 d，摘除眼球，眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死小鼠，无菌取脾脏制备脾细胞，在50%PEG-1500作用下与NS0细胞融合；将融合后的细胞悬液加到已铺有饲养细胞层的96孔细胞培养板中，用HAT培养基置于37℃5%CO2培养箱培养。

1.5.3 融合细胞的培养及阳性杂交瘤的筛选与克隆融合细胞于第10 d用HT培养液半量换液；用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，而后扩大培养、冻存、鉴定和建株。

1.5.4 MAb制备 参照文献[17]用体内诱生腹水法制备MAb。

1.6 MAb免疫学特性鉴定

1.6.1 效价测定 间接ELISA测定其效价。

1.6.2 敏感性鉴定 用阻断ELISA测定3C6 MAb对不同浓度NFLX的抑制率，以吸光率B/B0(B为NFLX不同浓度的OD450nm值，B0为NFLX 0标准浓度的OD450nm值)为纵坐标，以不同浓度NFLX的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，进行相关回归分析，计算3C6 MAb对NFLX的IC50。

1.6.3 特异性鉴定 NFLX及其同系喹诺酮类药物作为抑制剂，用阻断ELISA测定各抑制物的IC50，以MAb对NFLX的IC50与各抑制物的IC50之比的百分数为其交叉反应率(CR%)[18]。

2 结果

2.1 人工抗原鉴定结果 BSA的吸收峰在278 nm，NFLX的最大吸收峰在272 nm，325 nm处也有一吸收峰。BSA与NFLX偶联后，280 nm处两者的峰叠加，325 nm处也有NFLX特征峰出现，表明偶联成功；依据朗伯-比尔定律，推算BSA与NFLX的分子结合比约为1∶16.8(图 1)。SDS-PAGE鉴定显示，BSA的泳动速度大于BSA-NFLX，表明BSANFLX的分子量大于BSA，证明偶联成功(图2)。

2.2 小鼠血清效价敏感性测定结果 免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-4，获得较好的免疫效果(图3)，其中1号鼠血清效价较高，并且IC50最低(图4)，用于细胞融合。

2.3 杂交瘤细胞株的建立 细胞融合后10 d观察融合效果，4块细胞培养板384孔中有杂交瘤克隆形成的326孔，融合率为85%；间接ELISA检测，强阳性23孔，强阳性率为7.1%；3次亚克隆后获得4株杂交瘤，分别测定其IC50，筛选出2株杂交瘤，分别命名为3C6、3G11，经多次传代、冻存及复苏，杂交瘤细胞分泌抗体稳定。

2.4 MAb免疫学特性鉴定结果

2.4.1 效价测定结果 杂交瘤分泌的抗NFLX MAb具有较高的效价，两株杂交瘤3C6和3G11株效价相似，细胞培养上清和腹水效价分别达到1∶5.12×102和 1∶6.4×105(表 1)。

2.4.2 敏感性鉴定结果 3C6 MAb标准抑制曲线的线性回归方程为y＝-37.043x+85.918，根据回归方程计算出 3C6 MAb对 NFLX 的 IC50为 2.52 μg/L，本实验所获得的MAb对NFLX具有较高的敏感性(图 5)。

表1 NFLX MAb的间接ELISA效价Table 1 The indirect ELISA titer of NFLX MAb

2.4.3 交叉反应试验 NFLX的 IC50为 2.52 μg/L，NFLX MAb对二氟沙星有0.028%的交叉反应性，对沙拉沙星有小于0.016%的交叉反应性，对其它抑制物无交叉反应(表2)。

3 讨论

为获得稳定分泌抗目标抗原抗体的杂交瘤细胞株，免疫抗原须具备较高的纯度和合适的偶联比率，针对不同免疫对象应用不同的载体蛋白、剂量、佐剂和免疫周期，激发受免动物对该抗原的适度免疫应答，以利于获得高特异性、高亲和力的抗体。本实验使用高纯度的完全抗原免疫，适量的免疫剂量和周期，获得了较为理想的免疫效果，免疫小鼠多抗血清的半数抑制已经满足了国家标准的检测需求。高特异性、高亲和力MAb的获得，除了良好的免疫效果外，还需要有效的筛选系统。本实验免疫多抗血清使用阻断ELISA，用来甄别遴选具备高效价高亲和力的小鼠，使用亲和力最高的小鼠进行MAb制备，并以此获得了理想的杂交瘤细胞株。MAb的特异性由同类药物对NFLX抗体的交叉反应来体现，除与二氟沙星和沙拉沙星有较小的交叉反应以外，与其抑制物的交叉反应性都低于0.01%，表明本实验制备的NFLX杂交瘤细胞株具备较高的特异性。本研究合成NFLX完全抗原，获得了满意的免疫效果，通过杂交瘤技术获得2株高亲和力和高特异性的、稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，为NFLX残留快速检测产品的研制提供了保证。

表2 NFLX MAb与其他药物的交叉反应Table 2 The cross-reactivity of NFLX MAb with other compounds

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