徐 宁,王 莉,牛争平,孙美珍

癫痫是脑神经元异常放电反复发作引起的突然短暂脑功能紊乱的临床综合征[1]。中医药治疗癫痫已有两千多年历史,在治疗癫痫方面积累了丰富的经验。半夏超临界CO2乙醇提取物可剂量依赖性对抗小鼠最大电休克和戊四唑惊厥[2]。半夏、钩藤4∶1合用时抗癫痫效应协同、毒性拮抗[3]。为进一步证实两药4∶1配伍后的协同抗癫痫效应,本研究进一步观察了半夏、钩藤提取物单药及4∶1配伍对青霉素(PNC)皮层定位注射诱发大鼠惊厥发作和痫性放电的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康清洁级 Wistar大鼠,体重180 g～220 g,合格证号为:314第070102号,雌雄皆用,单笼喂养;由山西医科大学实验动物中心提供,符合国家健康一级动物标准。

1.1.2 药品与试剂 药品:钩藤(Uncariae,UN)、半夏 Pinellia ternate(PT)均购于山西省药材公司,由山西医科大学药学系植化教研组老师鉴定。半夏、钩藤的乙醇回流提取:将生药材粉碎成 20目,加入相当于药材量的6倍体积的70%乙醇后,浸泡24 h,然后用回流方法加热煮沸两次,每次2 h,纱布过滤,合并两次滤液,用旋转蒸发仪(浓缩温度60℃,压力 9 M pa)浓缩成800%(W/V)溶液,置冰箱冷藏备用,使用时用蒸馏水稀释至所需浓度。托吡酯(Topamax),瑞士 Cilag公司生产,批号02CS063。用生理盐水配制。试剂:青霉素钠(Benzylpencillin Sodium),华北制药股份有限公司生产,冀卫药准字(1995)第000004号,批号U0204033;乌拉坦(Urethane),上海曹杨第二中学化工厂生产,批号820420;用蒸馏水配置至所需浓度。

1.1.3 仪器 旋转蒸发器RE-52AA,上海亚荣生化仪器厂制造;DZTW型调温电热套,北京市永光明医疗仪器厂制造;江弯Ⅰ型-C脑立体定向仪,上海川沙花木农机厂制造;RM6240C型多道生理信号采集处理系统,成都仪器厂制造。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 取Wistar大鼠称重并灌胃(ig)受试药物后,腹腔注射25%乌拉坦 0.4 mL/100 g麻醉,固定于江弯Ⅰ型-C脑立体定向仪上,脑正中矢状切口切开头皮3cm,剥离骨膜,按照Konig定位图谱在大鼠左侧额叶皮层(前囟后3 mm,中线旁2 mm,硬脑膜下0.5 mm)和海马(前囟后3.8 mm,中线旁2.0 mm,硬脑膜下2.6 mm)区分别将两根直径0.5 mm的不锈钢电极插入相应部位作为引导电极,并与RM6240C多道生理信号采集处理系统相连。于各药作用高峰期用微量注射器硬膜下(感觉运动皮层)定位注射青霉素400 U,当脑电图出现尖波、棘波或尖(棘)慢波综合波时造模成功。

1.2.2 实验动物分组及给药 取Wistar大鼠36只,随机分为5组,每组6只。对照组(假手术组)给予生理盐水;模型组(PNC组)给予生理盐水;托吡酯组予 0.154 g/kg托吡酯;半夏组予36.4 g/kg半夏;钩藤组予38.5 g/kg钩藤;半夏和钩藤联合组予24.5 g/kg;以上各组均采用皮层定位注射给药。

1.2.3 观察指标 行为观察参照Racine分级标准[4]。硬膜下注药后连续观察大鼠行为1 h,并记录痫性发作的潜伏期和发作程度。以注药到首次出现须动所需的时间为潜伏期;以出现Ⅲ级～Ⅳ级发作为重度发作,仅出现Ⅲ级或Ⅲ级以下轻度发作。脑电观察指标:将电极插入额叶及海马后与 RM6240C多道生理信号采集处理系统相连,并将脑电信号输入电脑,用RM6240C软件进行脑电信号的频谱分析。硬膜下微量注射青霉素后,连续记录脑电图5 min,以后每5 min记录1 min至1 h,同时观察大鼠的行为变化。当出现尖波、棘波、尖(棘)慢波综合波、多棘慢波时判定为痫性活动。观察并统计痫性放电的潜伏期、放电最高波幅、癫痫波发放频率。以注射青霉素到首次出现痫性放电波的时间为潜伏期,取 10个1 min EEG中的尖波或棘波数目的均数作为每分钟平均痫波发放频率。

2 结 果

2.1 行为学比较 模型组6只大鼠(100%)在注入PNC后开始发作即表现为节律性四肢同时抽动(Ⅳ级),持续至实验结束(1 h)。钩藤单药组和半夏单药组有5只大鼠出现Ⅲ级以下的轻型发作,其中只有1只发展为Ⅳ级发作,持续20 min恢复正常。联用组和托吡酯组各有4只大鼠出现轻型发作,均未发展为重型发作,发作持续20 min后转为正常。痫性发作的潜伏期以联用组为最长,依次为托吡酯组、半夏单药组、钩藤单药组。与模型组相比有统计学意义(P＜0.05)。与两单药组相比,联用组均较之延长(P＜0.05),而与托吡酯组比较在数值上有所延长,但无统计学意义(P＞0.05)。详见表1。

表1 半夏、钩藤提取物对大鼠惊厥发作潜伏期和发作程度的影响

2.2 脑电图比较 正常大鼠大脑海马及皮层脑电图以9/min～10/min或17/min～19/min的α、β波为主要表现,无明显节律性,波幅0.04 mV～0.07 mV。正常对照组大鼠ig后,脑电无明显改变。模型组硬膜下注射PNC 63.46 s±11.55 s(海马),69.73 s±14.04 s(皮层)后开始出现痫波,多为尖波、棘波和棘慢波。痫波的发放频率为40.17/min±3.97/min(海马),40.50/min±5.68/min(皮层),波幅最高可达1.09 mV±0.11 mV(海马)、1.32 mV±0.36 mV(皮层)。详见表2、表3。

表2 半夏、钩藤提取物对惊厥大鼠海马痫性放电潜伏期、痫波发放频率和最高波幅的影响(±s)

表2 半夏、钩藤提取物对惊厥大鼠海马痫性放电潜伏期、痫波发放频率和最高波幅的影响(±s)

组别 剂量 痫性放电潜伏期s痫波发放频率t/m最高波幅mV模型组63.46±11.55 40.17±3.97 1.09±0.11半夏组 36.4 g/kg 119.36±17.981) 20.50±7.961) 0.62±0.251)钩藤组 38.5 g/kg 117.54±12.811) 22.83±9.541) 1.00±0.301)联用组 24.5 g/kg 183.26±19.751)2)3)4) 21.17±5.271) 0.82±0.272)托吡酯组 0.154 g/kg 129.04±7.551) 25.00±4.341) 1.13±0.22与模型组比较,1)P＜0.01;与托吡酯组比较,2)P＜0.05;与半夏组比较,3)P＜0.05;与钩藤组比较,4)P＜0.05

表3 半夏、钩藤对惊厥大鼠皮层痫性放电潜伏期、痫波发放频率和最高波幅的影响

2.2.1 痫性放电潜伏期比较 海马脑电图结果中痫性放电潜伏期以联用组为最长,其余依次为托吡酯、半夏单药组、钩藤单药组,与模型组相比均可延长痫性放电的潜伏期(P＜0.01)。联用组分别与两单药组和托吡酯组相比,均能显著延长潜伏期(P＜0.05)。皮层脑电图结果显示,皮层痫性放电潜伏期实验结果同海马,只有数值上的不同。各组皮层和海马脑电图的潜伏期的组间比较无统计学意义(P＞0.05)。

2.2.2 痫性放电频率比较 海马脑电图痫波发放频率以半夏单药组为最少,其余依次为联用组、钩藤单药组、托吡酯组,与模型组相比痫波发放频率均显著减少(P＜0.01)。联用组与两单药组相比,无统计学意义(P＞0.05)。

2.2.3 痫波最高波幅比较 海马脑电图结果中只有半夏单药组痫波最高波幅与模型组相比有降低(P＜0.01)。皮层脑电图结果可以看出,半夏、钩藤单药组痫波最高波幅与模型组相比均有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨 论

中医理论认为,癫痫的病因是由多种因素导致痰浊内生,痰聚而气逆不顺,或气郁化火,火生风动,挟痰上蒙清窍,横窜经络,内扰神明,而致癫痫发作[5],在治疗上以化痰、熄风、泻火、祛瘀、行气、补气等为治疗原则。中药配伍是中药临床应用的主要形式。《本经》提出充分利用相须、相使等协同增效配伍,以提高疗效;对有毒副反应的药物,则利用相制配伍,以抑制毒性,保证安全用药;对某些确有可能引起药效下降(相恶)或产生不良反应的(相反),则避免合用。马融等[6]认为痰邪是造成癫痫的中心环节,五志过极化火生风夹痰,上犯清窍;或因脏腑娇嫩,卒受惊恐,气机逆乱,痰浊随气上逆,蒙闭心神是本病的主要病机。按中药合理配伍原则,本实验选取平肝熄风药钩藤和化痰药半夏提取物进行4∶1配伍,观察了配方的抗惊厥作用。研究表明,半夏和钩藤合用不但对抗青霉素诱发的惊厥行为活动,同时可明显抑制异常脑电活动。表现在显著延长痫性发作潜伏期和痫性放电的潜伏期,且该作用较两药单独应用时强。

青霉素是经典的致痫剂,其急性或点燃癫痫动物模型已获公认。对于青霉素诱发的癫痫活动随其给药方法的不同而异,如果是腹腔或侧脑室给药,痫性活动与人类失神性癫痫相似,如果是大脑皮层一侧运动区定位注射则与人类简单部分性发作类似[7],如果是颞叶给药,则与人类精神运动性发作类似。青霉素为α-氨基丁酸(GABA)受体阻断剂[8],它引起的发作可能是由于它与GABA受体结合,阻断了与受体偶联的氯离子通道,从而阻断了GABA引起的突触后抑制的结果。当神经元兴奋性突触后电位(EPSP)综合超过一定阈值即可产生阵发性去极化飘移(paroxymal depolarization shifts,PDS)。PDS是癫痫电生理学的主要特征之一,脑电图记录到的棘波就是PDS有关动作电位的反映[9]。半夏和钩藤乙醇提取物单用和4∶1配伍用药能明显抑制青霉素皮层定位注射诱发的痫性放电,虽然两药单用和合用对痫波发放频率及最高波幅的抑制作用无差异,但延长痫性放电潜伏期和降低最高波幅作用较托吡酯明显,且作用性质与托吡酯相似。托吡酯能增强小脑颗粒细胞GABA介导的Cl-内流,其抗癫痫机制可能与GABA系统功能增强有关[10]。可以认为半夏和钩藤合用通过抑制青霉素皮层定位注射诱发的痫性放电和惊厥行为而对简单部分性癫痫发作产生良好的对抗作用,推测其抗痫作用机制与影响GABA系统有关。

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